一种用于评估细胞DNA损伤的高通量彗星检测方法

本研究使用了市售血液样本。在我们的机构，使用市售血液不需要机构审查委员会的批准。 1. 彗星测定材料的制备 显微镜载玻片的制备将1%（w / v）正常熔点琼脂糖[溶解在双蒸水（ddH 2 O）中]倒入50 mL管中，并微波将琼脂糖溶解在ddH2O中。如果发生凝固，请丢弃并准备新鲜。 通过将载玻片浸入含有 1% （w/v） 正常熔点琼脂糖的 50 mL 管中，对显微镜载玻片进行预涂。 浸渍幻灯片后快速擦拭幻灯片的背面。注意：在显微镜分析步骤中，未能正确擦拭载玻片背面会增加载玻片的背景噪音。 在磨砂部分的右下角用永久性标记标记涂层载玻片（图3A）。这显示了载玻片的哪一侧是预涂的。 让琼脂糖凝固并在室温下干燥过夜。 将干燥的载玻片包裹在薄纸中并存放在盒子中。 2. 样品的制备 培养细胞注意：首先，在开始彗星测定之前用破坏剂处理细胞。然后，执行以下操作。如果细胞贴壁，则在适当的细胞汇合处对细胞进行胰蛋白酶消化，以将其从细胞培养瓶或细胞培养培养皿中释放出来。通过添加含血清的培养基来中和胰蛋白酶。 将细胞转移到 50 mL 管中，离心（例如，对于 HaCaTs，在室温下以 300 x g 离心 5 分钟），轻轻除去上清液，并向细胞沉淀中加入 1 mL PBS。 进行细胞计数。 将30，000个细胞转移到1.5mL微量离心管中，并在4°C下以7，607× g 离心5分钟。 在进行彗星测定之前，轻轻除去上清液并将细胞沉淀储存在黑暗中的冰上。注意：在进行彗星测定之前，应定期测试细胞的支原体污染，以防止形成人工DNA损伤和改变的DNA损伤反应，如其他地方报道的那样23。离心条件可根据需要使用改变，具体取决于所使用的细胞类型。 制备用于修复测定的培养细胞在细胞培养瓶或培养皿中培养细胞。 在用损伤剂处理细胞之前，用 1 mL PBS 洗涤细胞两次（例如，对于 BE-M17 细胞，用 50 μM H 2 O2处理 20 分钟）在冰上以防止在处理过程中发生修复。 用 1 mL PBS 轻轻清洗细胞两次，以去除任何残留的有害物质。 重新引入细胞培养基，并让细胞在加湿培养箱（37°C，5%CO 2）中修复不同的持续时间（例如，0分钟，30分钟，2小时，6小时，24小时和30小时）。 在每个时间点，在含有10%二甲基亚砜（DMSO）的细胞培养基中收集30，000个细胞，并将其储存在-80°C。 在进行彗星测定之前，在水浴中以37°C快速解冻细胞，并在4°C下以7，607× g 离心5分钟。 在进行测定之前，除去上清液并将细胞沉淀储存在冰上（即，从步骤3开始）。 全血制备注意：以下方法受益于（i）是获取血液样本的微创方法，（ii）在彗星测定之前不需要分离PBMC，以及（iii）允许血液样品（体积<250μL）在-80°C下储存长达1个月（尽管最近的证据表明可以保存更长时间）， 无需冷冻保存剂，无风险或人为损害形成14.在从患者或动物身上获取血液样本之前，可能需要获得伦理批准或同等批准。或者，市售的血液样品可以如本研究一样使用。在我们的机构，使用市售血液不需要机构审查委员会的批准。使用移液器将全血样品（<250 μL）（材料表）转移到含有最小体积的收集管中，该收集管含有0.4 mg EDTA（每250 μL血液）。 在进行HTP彗星测定之前，将血液样品冷冻在-80°C。 在室温下解冻储存的血液样品（<250μL），无需加热。 在进行彗星测定之前，将 5 μL 全血转移到微量离心管中（参见步骤 3）。 3. 细胞裂解 注意：在冰上执行所有程序。 每块凝胶使用 12，000 个细胞或 2.5 μL 全血。 使用微波制备溶解在PBS中的0.6%（w / v）低熔点琼脂糖，并置于37°C的水浴中以防止其凝固。 使用永久性记号笔或铅笔在预涂布载玻片的磨砂端标记研究者的姓名、日期和治疗信息。 将冷却板放在平坦的工作台上，然后将两个冷冻冷却包插入金属表面下方的滑动抽屉中（如图 4所示）21。 将载玻片放在冷却板上，让载玻片预冷1-2分钟，然后加入含0.6%（w / v）的低熔点琼脂糖细胞（步骤3.7）。注意：由于环境湿度，将载玻片放在冷却板上超过 1-2 分钟可能会导致载玻片表面形成冷凝。这可能导致低熔点琼脂糖凝胶在载玻片上的稳定性降低。 通过涡旋分散沉淀（步骤2.2.7）。确保已从沉淀中除去所有上清液。将样品管（包含沉淀细胞）立即放回冰上。注意：将含样品的试管放入离心机时，将它们的铰链朝外放置，以便将沉淀收集在试管的这一侧。有时很难看到沉淀，并且在去除上清液时很容易将其移开。用管盖以这个方向离心将使人知道细胞沉淀的位置。 用 200 μL 0.6% 低熔点琼脂糖（LMP 琼脂糖）重悬细胞沉淀，并通过上下移液混合而不会产生气泡。接下来，快速将 80 μL 含 LMP 琼脂糖的细胞转移到冷却载玻片上，并快速将盖玻片放在凝胶上。 让凝胶在冷却板上凝固1-2分钟。 同时，制备500 mL裂解缓冲液的工作溶液（表1），并将其倒入裂解皿中（图2）。 凝胶凝固后，用拇指和食指轻轻握住载玻片并将盖玻片从凝胶上滑下，快速取出盖玻片。 将含有样品的载玻片放在载玻片内（载玻片上的所有黑色“点”标记在载玻片中放置时应朝向同一方向）（图3B），然后将载玻片放在裂解皿内（图2）。 关闭裂解盘的盖子，并将裂解盘在冰箱中在4°C下过夜或在室温下30分钟，以最适合操作员的时间表19为准。 4. 电泳 小心地从裂解培养皿中取出载玻片载体。注意不要干扰凝胶。 轻轻地将载玻片托架放入预装有冰冷的ddH 2 O的洗涤盘中，静置30分钟，确保载玻片完全被ddH2O覆盖。 将冷冻冷却包插入电泳槽下方的滑动抽屉内，以保持最佳缓冲温度。 小心地将冰冷的电泳工作溶液（表1）加入电泳槽中，并将载玻片转移到电泳槽中。定向载玻片，使其带有含细胞凝胶的透明部分（即，不是磨砂/标记端）指向阴极（红色电极）。 让载玻片在电泳槽中静置20分钟，使DNA放松并展开。在此步骤中保持电源关闭。 如果需要，插入新的冷冻冷却包以最大限度地提高冷却效果。 在1.19V / cm或任何已优化的条件下进行电泳20分钟。注意：建议每个实验室优化电泳运行条件和缓冲液体积24.在电泳过程中仅使用单个载玻片不会对电泳缓冲液的电阻产生任何影响，并且当载玻片数量发生变化时，作者没有看到电压或电流的显着影响。 关闭电源，小心地从电泳槽中取出载玻片载体，让它在薄纸上排出 30 秒。 将载玻片放入含有中和缓冲液的培养皿中（表1）。静置20分钟。 从中和盘中取出载玻片载体，将其放入含有冰冷ddH2O的洗涤盘中，放置20分钟。 从水中取出载玻片载体，让载玻片在37°C的培养箱中干燥1小时，或在室温下干燥过夜，或者不要干燥，具体取决于操作员的时间表19。注意：如果在步骤4.11中没有干燥，请执行5.2中的染色步骤。 5. 碘化丙啶（PI）染色 将载玻片载体转移到含有冰冷ddH2O的洗涤盘中，使载玻片再水化并放置30分钟。 将载玻片支架放入含有 2.5 μg/mL 碘化丙啶溶液的染色皿中。注意：碘化丙啶对光敏感，因此请在黑暗区域处理。它也是有毒的。 关闭染色皿的盖子，并在室温下在黑暗中孵育20分钟。 将载玻片载体转移到单独的培养皿中，并用冰冷的ddH2O清洗20分钟。 从培养皿中取出载玻片载体，并在黑暗中完全干燥，无论是在37°C培养箱中还是在室温下，具体取决于操作员的时间表或偏好。 载玻片完全干燥后，将其从载玻片托架中取出，并在黑暗中存放在载玻片盒中，直到准备好进行图像分析。注意：载玻片将无限期保持可读性，必要时可以重新染色。 6. 酶修饰碱性彗星测定 注意：酶修饰的碱性彗星测定在裂解后但在电泳之前采用酶处理步骤。酶的活性导致作为酶底物的位点的DNA断裂。在进行该测定之前，必须优化酶浓度和酶孵育持续时间。 细胞裂解后（步骤3），用冰冷的ddH2O洗涤载玻片两次，每次20分钟。 从水中取出载玻片托架，然后将载玻片转移到衬有纸巾的托盘中。 以优化浓度加入 80 μL 酶（例如，用于 BE-M17 细胞的 hOGG1 为 3.2 U/mL，在酶反应缓冲液中稀释），并用盖玻片覆盖以将酶铺在含凝胶的样品上。 将载玻片在37°C孵育优化持续时间（例如，hOGG1为45分钟）。 孵育后，轻轻取出盖玻片并将载玻片转移到载体上。注意：酶处理后不要清洗载玻片;直接从步骤4.3进行电泳。 7. DNA链间交联（ICL）修饰的碱性彗星测定 注意：ICL-ACA的这种变体的概念是，DNA中ICL的存在将延迟受损DNA的电泳迁移，这是在暴露于氧化产生的损伤后诱导的。在这种情况下，彗尾越短，ICL25，26，27，28的数量就越多。 用诱导ICL的试剂（例如顺铂;参见 补充文件）处理细胞。 用以下试剂之一暴露处理过的细胞，以诱导足够的链断裂以产生适当大小的彗尾（~20%尾部DNA）：过氧化氢（50μM H 2 O230分钟），电离辐射（2-5Gy）或紫外线B（UVB）（0.5J / cm2）。 此外，通过用步骤7.2中使用的相同试剂和剂量处理一批细胞来产生链断裂阳性对照（即，不使用ICL诱导剂处理）。 将细胞以7，607× g 离心5分钟，弃去上清液，用1mL PBS洗涤细胞沉淀三次，并像碱性彗星测定一样处理（步骤3-5）。 使用以下公式计算DNA链间交联的水平。注意：MOTM（平均橄榄尾巴力矩）是描述ICL修饰彗星测定时广泛使用的彗星测定终点，定义为尾巴长度与尾部总DNA分数的乘积（即尾部力矩=尾部长度x尾部DNA的百分比）29;TMdi：用交联剂和H2O2（或其他断链诱导剂）处理的样品的尾部力矩;TMcu：未用交联剂处理且未用H2O 2处理（无处理）处理的样品的尾部矩，TMci：未用交联剂处理但用H 2 O 2处理的样品的尾部矩。 8. 彗星评分和数据分析 注意：术语“彗星”源自在进行测定后在显微镜下观察受损细胞的图像（图5）。在电泳条件下，未受损细胞中的DNA基本上不会迁移，而是保留在称为彗星“头部”的球体中。然而，链断裂的存在允许细胞的DNA从头部迁移出来，并形成“尾巴”，从而导致像彗星一样的外观（图5）。尾巴中的DNA越多，损伤就越大。 使用PI（红色）滤光片（λ = 536/617 nm）和彗星测定评分软件打开荧光显微镜。 使用巴斯德移液管在凝胶中加入一滴水，并盖上盖玻片。 将载玻片放入荧光显微镜中并对彗星进行“评分”。注意：评分是评估彗星的一种手段，以确定每颗彗星中存在的损坏量。从广义上讲，这可以通过使用两种方法来实现，根据用户选择的偏好，要么通过肉眼（以0到4的尺度测量彗星的大小），要么使用自由的或市售的软件30。一般来说，这两种方法都评估彗尾的大小，尽管可以确定各种与彗星相关的终点。如果使用该软件，请单击彗星头的中间，等待软件自动检测到彗星，然后评估所选端点（图5）。 每个凝胶50颗彗星，每个样品100颗彗星（即，每个样品对应于不同的DNA损伤处理或其重复）。 重复实验（n = 2）或将实验一式三份（n = 3）。注意：如果仅进行n = 2重复实验，则无法进行统计分析，但如果n = 3，则执行D’agostino正态性检验。大多数彗星检测数据没有通过正态性测试。在这种情况下，请使用非参数检验（Kruskal-Wallis 检验与邓恩多重比较检验，曼-惠特尼检验显著性设置为 p < 0.05）。