Vollkreiskauterisierung des limbalen Gefäßplexus bei chirurgisch induziertem Glaukom bei Nagetieren
Özet
Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein neuartiges Modell der glaukomatösen Neurodegeneration zu charakterisieren, das auf einer thermischen 360°-Kauterisierung des limbalen Gefäßplexus basiert und eine subakute okuläre Hypertonie induziert.
Abstract
Das Glaukom, die zweithäufigste Erblindungsursache weltweit, ist eine heterogene Gruppe von Augenerkrankungen, die durch eine strukturelle Schädigung des Sehnervs und eine Degeneration der retinalen Ganglienzellen (RGC) gekennzeichnet sind, die zu einer Sehstörung führt, indem die Übertragung visueller Informationen vom Auge zum Gehirn unterbrochen wird. Ein erhöhter Augeninnendruck ist der wichtigste Risikofaktor; Daher wurden mehrere Modelle der okulären Hypertonie bei Nagetieren entweder durch genetische oder experimentelle Ansätze entwickelt, um die Ursachen und Auswirkungen der Krankheit zu untersuchen. Unter diesen wurden einige Einschränkungen berichtet, wie z. B. chirurgische Invasivität, unzureichende funktionelle Beurteilung, die Notwendigkeit einer umfangreichen Ausbildung und eine sehr variable Ausdehnung der Netzhautschäden. Die vorliegende Arbeit charakterisiert eine einfache, kostengünstige und effiziente Methode zur Induktion von okulärer Hypertonie bei Nagetieren, die auf der Kauterisierung des limbalen Gefäßplexus bei niedriger Temperatur, einer Hauptkomponente der Kammerwasserdrainage, basiert. Das neue Modell bietet eine technisch einfache, nicht-invasive und reproduzierbare subakute okuläre Hypertonie, die mit einer progressiven RGC und einer Degeneration des Sehnervs einhergeht, sowie eine einzigartige postoperative klinische Genesungsrate, die in vivo funktionelle Studien sowohl mit elektrophysiologischen als auch mit verhaltenstherapeutischen Methoden ermöglicht.
Introduction
In der medizinischen Literatur wird das Glaukom als eine heterogene Gruppe von Optikusneuropathien verstanden, die durch eine fortschreitende Degeneration von retinalen Ganglienzellen (RGCs), Dendriten, Soma und Axonen gekennzeichnet sind, was zu einem strukturellen Schröpfen (Exkavation) der Papille und einer funktionellen Verschlechterung des Sehnervs führt, was in unkontrollierten Fällen zu einer Amaurose führt, indem die Übertragung visueller Informationen vom Auge zum Gehirn unterbrochen wird1. Das Glaukom ist derzeit weltweit die häufigste Ursache für irreversible Erblindung und wird im Jahr 2040 voraussichtlich etwa 111,8 Millionen Menschen erreichen2, was die Lebensqualität der Patienten stark beeinträchtigt und zu erheblichen sozioökonomischen Problemen führt3.
Ein erhöhter Augeninnendruck (IOD) ist einer der wichtigsten und einzigen modifizierbaren Risikofaktoren für die Entstehung und das Fortschreiten des Glaukoms. Unter den verschiedenen Arten von Glaukom sind alle, mit Ausnahme des Normaldruckglaukoms (NTG), mit einem erhöhten Augeninnendruck zu einem bestimmten Zeitpunkt in der klinischen Geschichte der Krankheit verbunden. Trotz bemerkenswerter klinischer und chirurgischer Fortschritte, um den Augeninnendruck zu bekämpfen und das Fortschreiten der Krankheit zu verlangsamen oder zu stoppen, verlieren Patienten aufgrund eines Glaukoms immer noch ihr Augenlicht 4,5. Daher ist ein gründliches Verständnis der komplexen und multifaktoriellen Pathophysiologie dieser Krankheit unerlässlich für die Entwicklung wirksamerer Behandlungen, insbesondere zur Neuroprotektion von RGCs.
Unter einer Vielzahl von experimentellen Ansätzen zum Verständnis von Krankheitsmechanismen ähneln Tiermodelle, die auf okulärer Hypertonie (OHT) basieren, am ehesten dem menschlichen Glaukom. Nagetiermodelle sind besonders nützlich, da sie kostengünstig sind, einfach zu handhaben sind, genetisch manipuliert werden können, eine kurze Lebensdauer haben und anatomische und physiologische Merkmale aufweisen, die mit denen des Menschen vergleichbar sind, wie z. B. Kammerwasserproduktion und -drainage 6,7,8,9,10,11,12,13 . Zu den derzeit verwendeten Modellen gehören die Sklerose des Trabekelwerks nach Injektion von hypertoner Kochsalzlösung in episklerale Venen14, die intrakamerale Injektion von Mikrokügelchen 15 oder viskoelastischen Substanzen 16, die Kauterisierung von Wirbelvenen17, die Photokoagulation des Trabekelwerks mit dem Argonlaser 18, die zirkumlimbale Naht 19 und die Verwendung eines transgenen Modells der altersabhängigen OHT (DBA/2J-Mäuse)8. Invasivität, postoperative Trübung der Hornhaut, Störung des vorderen Augenabschnitts, umfangreiche Lernkurven, teure Geräte und stark schwankende postoperative IOPs gehören jedoch zu den berichteten Fallstricken, die mit den aktuellen Modellen verbunden sind, so dass die Entwicklung eines alternativen OHT-Modells erforderlich ist, um diese Probleme zu überwinden20,21,22.
Das vorliegende Protokoll formalisiert ein neuartiges chirurgisches Verfahren zur Induktion von OHT als Stellvertreter für das Glaukom, basierend auf der Kauterisierung des Limbusplexus (LPC) bei Nagetieren23. Dies ist ein einfaches, reproduzierbares, zugängliches und nicht-invasives Modell, das eine hohe Effizienz und geringe Variabilität der IOD-Erhöhung bietet, verbunden mit einer einzigartig hohen Rate der vollständigen klinischen Genesung, und somit eine In-vivo-Funktionsbewertung bei einer reduzierten Anzahl von Tieren ermöglicht, die in jedem Experiment verwendet werden. Die Operationstechnik induziert eine subakute OHT mit einer allmählichen Rückkehr zum Ausgangswert innerhalb weniger Tage, was den hypertensiven Anfall beim akuten Winkelverschlussglaukom modelliert. Darüber hinaus folgt auf die IOD-Erholung im Modell eine kontinuierliche glaukomatöse Neurodegeneration, die für zukünftige mechanistische Studien der sekundären Degeneration von RGCs nützlich ist, die in mehreren Fällen von humanem Glaukom trotz adäquater Kontrolle des IOD auftritt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Limbus-Plexus-Kauterisation (LPC) ist ein neuartiges posttrabekuläres Modell mit dem Vorteil, dass es auf leicht zugängliche Gefäßstrukturen abzielt, die keine Konjunktival- oder Zapfendissektion erfordern17,28. Anders als beim Vortex-Venen-Kauterisierungsmodell, einem renommierten OHT-Modell, das auf der chirurgischen Beeinträchtigung der Aderhautvenendrainage basiert, ist nicht zu erwarten, dass eine venöse Stauung den IOD-Anstieg im LPC-Modell beeinf…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken unseren Labortechnikern José; Nilson dos Santos, Daianne Mandarino Torres, José Francisco Tibúrcio, Gildo Brito de Souza und Luciano Cavalcante Ferreira. Diese Forschung wurde von FAPERJ, CNPq und CAPES finanziert.
Materials
| Acetone | Isofar | 201 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Active electrode for electroretinography | Hansol Medical Co | – | Stainless steel needle 0.25 mm × 15 mm |
| Anestalcon | Novartis Biociências S/A | MS-1.0068.1087 | Proxymetacaine hydrochloride 0.5% |
| Calcium chloride | Vetec | 560 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx | Bovie Medical Corporation | AA00 | Low-temperature ophthalmic cautery |
| Cetamin | Syntec do Brasil Ltda | 000200-3-000003 | Ketamine hydrochloride 10% |
| DAKO | Dako North America | S3023 | Antifade mounting medium |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 28718-90-3 | diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452±3 nm |
| Ecofilm | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0487 | Carmellose sodium 0.5% |
| EPON Resin | Polysciences, Inc. | – | Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA – Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA – Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 – 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553) |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16110 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Hyabak | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-8042140002 | Sodium hyaluronate 0.15% |
| Icare Tonolab | Icare Finland Oy | TV02 (model number) | Rebound handheld tonometer |
| IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A31570 | Secondary antibody solution |
| LCD monitor 23 inches | Samsung Electronics Co. Ltd. | S23B550 | Model LS23B550, for electroretinogram recording |
| LSM 510 Meta | Carl Zeiss | – | Confocal epifluorescence microscope |
| Maxiflox | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0489 | Ciprofloxacin 3.5 mg/g |
| MEB-9400K | Nihon Kohden Corporation | – | System for electroretinogram recording |
| monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a | MilliporeSigma | MAB-1585 | Brn3a primary antibody solution |
| Neuropack Manager v08.33 | Nihon Kohden Corporation | – | Software for electroretinogram signal processing |
| Optomotry | CerebralMechanics | – | System for optomotor response analysis |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19100 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Potassium ferrocyanide | Electron Microscopy Sciences | 20150 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Reference and ground electrodes for electroretinography | Chalgren Enterprises | 110-63 | Stainless steel needles 0.4 mm × 37 mm |
| Sodium cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Ster MD | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-1.0497.1287 | Prednisolone acetate 0.12% |
| Terolac | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0497.1286 | Ketorolac trometamol 0.5% |
| Terramicina | Laboratórios Pfizer Ltda | MS-1.0216.0024 | Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g |
| Tono-Pen XL | Reichert Technologies | 230635 | Digital applanation handheld tonometer |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher Scientific | T3605 | Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | Non-ionic surfactant |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Xilazin | Syntec do Brasil Ltda | 7899 | Xylazine hydrochloride 2% |
| Carl Zeiss | – | Stereo microscope for surgery and retinal dissection |
Referanslar
- Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. The Pathophysiology and Treatment of Glaucoma A Review. JAMA. 311 (8), 1901-1911 (2014).
- Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: A systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
- Quaranta, L., et al. Quality of Life in Glaucoma: A Review of the Literature. Advances in Therapy. 33 (6), 959-981 (2016).
- Heijl, A., et al. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial. Archives of Ophthalmology. 120 (10), 1268-1279 (2002).
- Susanna, R., De Moraes, C. G., Cioffi, G. A., Ritch, R. Why Do People (Still) Go Blind from Glaucoma. Translational Vision Science & Technology. 4 (2), 1 (2015).
- Fujikawa, K., et al. VAV2 and VAV3 as candidate disease genes for spontaneous glaucoma in mice and humans. PLoS One. 5 (2), 9050 (2010).
- Mao, M., Hedberg-Buenz, A., Koehn, D., John, S. W., Anderson, M. G. Anterior segment dysgenesis and early-onset glaucoma in nee mice with mutation of Sh3pxd2b. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2679-2688 (2011).
- John, S. W., et al. Essential iris atrophy, pigment dispersion, and glaucoma in DBA/2J mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (6), 951-962 (1998).
- Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Ocular hypertension in mice with a targeted type I collagen mutation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (4), 1581-1585 (2003).
- Chou, T. H., Tomarev, S., Porciatti, V. Transgenic mice expressing mutated Tyr437His human myocilin develop progressive loss of retinal ganglion cell electrical responsiveness and axonopathy with normal iop. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (9), 5602-5609 (2014).
- vander Zypen, E. Experimental morphological study on structure and function of the filtration angel of the rat eye. Ophthalmologica. 174 (5), 285-298 (1977).
- Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Aqueous humor dynamics in mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5168-5173 (2003).
- Morrison, J. C., Fraunfelder, F. W., Milne, S. T., Moore, C. G. Limbal microvasculature of the rat eye. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 751-756 (1995).
- Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64 (1), 85-96 (1997).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: A paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (1), 207-216 (2010).
- Zhu, M. D., Cai, F. Y. Development of experimental chronic intraocular hypertension in the rabbit. Australian and New Zealand Journal of Ophthalmology. 20 (3), 225-234 (1992).
- Shareef, S. R., Garcia-Valenzuela, E., Salierno, A., Walsh, J., Sharma, S. C. Chronic ocular hypertension following episcleral venous occlusion in rats. Experimental Eye Research. 61 (3), 379-382 (1995).
- Levkovitch-Verbin, H., et al. Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (2), 402-410 (2002).
- Zhao, D., et al. Characterization of the Circumlimbal Suture Model of Chronic IOP Elevation in Mice and Assessment of Changes in Gene Expression of Stretch Sensitive Channels. Frontiers in Neuroscience. 11, (2017).
- Biswas, S., Wan, K. H. Review of rodent hypertensive glaucoma models. Acta Ophthalmologica. 97 (3), 331-340 (2019).
- Pitha, I., et al. Sustained Dorzolamide Release Prevents Axonal and Retinal Ganglion Cell Loss in a Rat Model of IOP-Glaucoma. Translational Vision Science & Technology. 7 (2), 13 (2018).
- Grozdanic, S. D., et al. Temporary elevation of the intraocular pressure by cauterization of vortex and episcleral veins in rats causes functional deficits in the retina and optic nerve. Experimental Eye Research. 77 (1), 27-33 (2003).
- Lani, R., et al. A subacute model of glaucoma based on limbal plexus cautery in pigmented rats. Scientific Reports. 9 (1), 16286 (2019).
- vander Merwe, E. L., Kidson, S. H. The three-dimensional organisation of the post-trabecular aqueous outflow pathway and limbal vasculature in the mouse. Experimental Eye Research. 125, 226-235 (2014).
- Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).
- Sasovetz, D. Ketamine hydrochloride: an effective general anesthetic for use in electroretinography. Annals of Ophthalmology. 10 (11), 1510-1514 (1978).
- Stabio, M. E., et al. A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space. The Journal of Comparative Neurology. 526 (11), 1749-1759 (2018).
- Blanco, R., et al. A Chronic Ocular-Hypertensive Rat Model induced by Injection of the Sclerosant Agent Polidocanol in the Aqueous Humor Outflow Pathway. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3209 (2019).
- Paranhos, A., Prata, J. A., de Mello, P. A., da Silva, F. A. Post-Trabecular Glaucomas with Elevated Episcleral Venous Pressure. Mechanisms of the Glaucomas. , 139-157 (2008).
- Ou, Y., Jo, R. E., Ullian, E. M., Wong, R. O. L., Della Santina, L. Selective Vulnerability of Specific Retinal Ganglion Cell Types and Synapses after Transient Ocular Hypertension. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of The Society for Neuroscience. 36 (35), 9240-9252 (2016).
