Özet

Полное прижигание лимбального сосудистого сплетения при хирургически индуцированной глаукоме у грызунов

Published: February 15, 2022
doi:

Özet

Целью данного протокола является характеристика новой модели глаукоматозной нейродегенерации, основанной на термическом прижигании лимбального сосудистого сплетения на 360°, индуцирующем подострую глазную гипертензию.

Abstract

Глаукома, вторая по значимости причина слепоты во всем мире, представляет собой гетерогенную группу глазных заболеваний, характеризующихся структурным повреждением зрительного нерва и дегенерацией ганглиозных клеток сетчатки (RGC), что приводит к зрительной дисфункции из-за прерывания передачи визуальной информации от глаза к мозгу. Повышенное внутриглазное давление является наиболее важным фактором риска; Таким образом, было разработано несколько моделей глазной гипертензии у грызунов с помощью генетических или экспериментальных подходов для изучения причин и последствий заболевания. Среди них были выявлены некоторые ограничения, такие как хирургическая инвазивность, неадекватная функциональная оценка, необходимость интенсивной подготовки и очень вариабельная протяженность повреждения сетчатки. В настоящей работе охарактеризован простой, малозатратный и эффективный метод индуцирования глазной гипертензии у грызунов, основанный на низкотемпературном прижигании по всему кругу лимбального сосудистого сплетения, являющегося основным компонентом дренажа водянистой влаги. Новая модель обеспечивает технически простую, неинвазивную и воспроизводимую подострую глазную гипертензию, связанную с прогрессирующей РГК и дегенерацией зрительного нерва, а также уникальную скорость послеоперационного клинического восстановления, позволяющую проводить функциональные исследования in vivo как электрофизиологическими, так и поведенческими методами.

Introduction

В медицинской литературе глаукома понимается как гетерогенная группа оптических невропатий, характеризующихся прогрессирующей дегенерацией ганглиозных клеток сетчатки (РГК), дендритов, сомы и аксонов, что приводит к структурному купированию (выкапыванию) диска зрительного нерва и функциональному ухудшению зрительного нерва, приводящему в неконтролируемых случаях к амаврозу из-за прерывания передачи зрительной информации от глаза к мозгу1. В настоящее время глаукома является наиболее распространенной причиной необратимой слепоты во всем мире, и, по прогнозам, к 2040 г. она охватит примерно 111,8 миллионачеловек2, что оказывает глубокое влияние на качество жизни пациентов (КЖ) и приводит к серьезным социально-экономическимпроблемам3.

Повышенное внутриглазное давление (ВГД) является одним из наиболее важных и единственно модифицируемых факторов риска развития и прогрессирования глаукомы. Среди множества типов глаукомы все, за исключением глаукомы нормального напряжения (НТГ), связаны с повышенным ВГД в какой-то момент клинической истории заболевания. Несмотря на выдающиеся клинические и хирургические достижения в области воздействия на ВГД и замедления или остановки прогрессирования заболевания, пациенты по-прежнему теряют зрение из-за глаукомы 4,5. Поэтому глубокое понимание сложной и многофакторной патофизиологии этого заболевания является обязательным условием для разработки более эффективных методов лечения, особенно для обеспечения нейропротекции РГК.

Среди многообразия экспериментальных подходов к пониманию механизмов заболевания животные модели, основанные на глазной гипертензии (ОГТ), наиболее близки к глаукоме человека. Модели грызунов особенно полезны, поскольку они недороги, просты в обращении, могут быть генетически модифицированы, имеют короткую продолжительность жизни и обладают анатомическими и физиологическими особенностями глаза, сопоставимыми с человеческими, такими как выработка водянистой влаги и дренаж 6,7,8,9,10,11,12,13 . В настоящее время используются такие модели, как склероз трабекулярной сетки после введения гипертонического физиологического раствора в эписклеральные вены14, внутрикамерная инъекция микрогранул15 или вязкоэластичных веществ 16, прижигание вихревых вен 17, фотокоагуляция трабекулярной сетки аргоновым лазером 18, окололимбальный шов 19 и использование трансгенной модели возрастной ОГТ (мыши DBA/2J)8. Тем не менее, инвазивность, послеоперационное помутнение роговицы, разрушение переднего сегмента, обширные кривые обучения, дорогостоящее оборудование и высокая вариабельность послеоперационного ВГД являются одними из немногих зарегистрированных подводных камней, связанных с существующими моделями, что делает разработку альтернативной модели ГВТ требованием для преодоления этих проблем20,21,22.

Настоящий протокол формализует новую хирургическую процедуру для индуцирования ГТ в качестве прокси глаукомы, основанную на прижигании лимбального сплетения (ЛПК) у грызунов23. Это простая, воспроизводимая, доступная и неинвазивная модель, которая обеспечивает высокую эффективность и низкую вариабельность повышения ВГД, связанную с уникально высокой скоростью полного клинического выздоровления, что обеспечивает функциональную оценку in vivo на меньшем количестве животных, используемых в каждом эксперименте. Хирургический метод индуцирует подострую ГТ с постепенным возвращением к исходному уровню через несколько дней, что моделирует гипертонический приступ, наблюдаемый при острой закрытоугольной глаукоме. Кроме того, восстановление ВГД в модели сопровождается непрерывной глаукоматозной нейродегенерацией, что полезно для будущих механистических исследований вторичной дегенерации РГК, которая происходит в нескольких случаях глаукомы человека, несмотря на адекватный контроль ВГД.

Protocol

Все процедуры были выполнены в соответствии с Положением об использовании животных в офтальмологических и визуальных исследованиях Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) и одобрены Комитетом по этике по использованию животных в научных экспериментах Центра ме…

Representative Results

Количественные переменные выражаются в виде среднего значения ± стандартной ошибки среднего значения (SEM). За исключением сравнения динамики ВГД между ГВТ и контрольной группами (рис. 1F), статистический анализ проводили с использованием двуфакторного ANOVA с последующим ?…

Discussion

Прижигание лимбального сплетения (ЛПК) является новой посттрабекулярной моделью, преимущество которой заключается в том, что она нацелена на легкодоступные сосудистые структуры, не требующие диссекции конъюнктивы или шипа17,28. В отличие от модели прижиг…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы выражаем признательность нашим лаборантам Хосе; Нильсон душ Сантуш, Дайанн Мандарино Торрес, Хосе Франсиско Тибурсио, Жильдо Бриту де Соуза и Лучано Кавальканте Феррейра. Это исследование финансировалось FAPERJ, CNPq и CAPES.

Materials

Acetone Isofar 201 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Active electrode for electroretinography Hansol Medical Co Stainless steel needle 0.25 mm × 15 mm
Anestalcon Novartis Biociências S/A MS-1.0068.1087 Proxymetacaine hydrochloride 0.5%
Calcium chloride Vetec 560 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx Bovie Medical Corporation AA00 Low-temperature ophthalmic cautery
Cetamin Syntec do Brasil Ltda 000200-3-000003 Ketamine hydrochloride 10%
DAKO Dako North America S3023 Antifade mounting medium
DAPI Thermo Fisher Scientific 28718-90-3 diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452±3 nm
Ecofilm Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda MS-1.0298.0487 Carmellose sodium 0.5%
EPON Resin Polysciences, Inc. Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA – Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA – Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 – 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553)
Glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences 16110 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Hyabak União Química Farmacêutica Nacional S/A MS-8042140002 Sodium hyaluronate 0.15%
Icare Tonolab Icare Finland Oy TV02 (model number) Rebound handheld tonometer
IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555 Thermo Fisher Scientific A31570 Secondary antibody solution
LCD monitor 23 inches Samsung Electronics Co. Ltd. S23B550 Model LS23B550, for electroretinogram recording
LSM 510 Meta Carl Zeiss Confocal epifluorescence microscope
Maxiflox Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda MS-1.0298.0489 Ciprofloxacin 3.5 mg/g
MEB-9400K Nihon Kohden Corporation System for electroretinogram recording
monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a MilliporeSigma MAB-1585 Brn3a primary antibody solution
Neuropack Manager v08.33 Nihon Kohden Corporation Software for electroretinogram signal processing
Optomotry CerebralMechanics System for optomotor response analysis
Osmium tetroxide Electron Microscopy Sciences 19100 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Potassium ferrocyanide Electron Microscopy Sciences 20150 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Reference and ground electrodes for electroretinography Chalgren Enterprises 110-63 Stainless steel needles 0.4 mm × 37 mm
Sodium cacodylate buffer Electron Microscopy Sciences 12300 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Ster MD União Química Farmacêutica Nacional S/A MS-1.0497.1287 Prednisolone acetate 0.12%
Terolac Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda MS-1.0497.1286 Ketorolac trometamol 0.5%
Terramicina Laboratórios Pfizer Ltda MS-1.0216.0024 Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g
Tono-Pen XL Reichert Technologies 230635 Digital applanation handheld tonometer
TO-PRO-3 Thermo Fisher Scientific T3605 Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9036-19-5 Non-ionic surfactant
Uranyl acetate Electron Microscopy Sciences 22400 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Xilazin Syntec do Brasil Ltda 7899 Xylazine hydrochloride 2%
Carl Zeiss Stereo microscope for surgery and retinal dissection

Referanslar

  1. Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. The Pathophysiology and Treatment of Glaucoma A Review. JAMA. 311 (8), 1901-1911 (2014).
  2. Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: A systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
  3. Quaranta, L., et al. Quality of Life in Glaucoma: A Review of the Literature. Advances in Therapy. 33 (6), 959-981 (2016).
  4. Heijl, A., et al. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial. Archives of Ophthalmology. 120 (10), 1268-1279 (2002).
  5. Susanna, R., De Moraes, C. G., Cioffi, G. A., Ritch, R. Why Do People (Still) Go Blind from Glaucoma. Translational Vision Science & Technology. 4 (2), 1 (2015).
  6. Fujikawa, K., et al. VAV2 and VAV3 as candidate disease genes for spontaneous glaucoma in mice and humans. PLoS One. 5 (2), 9050 (2010).
  7. Mao, M., Hedberg-Buenz, A., Koehn, D., John, S. W., Anderson, M. G. Anterior segment dysgenesis and early-onset glaucoma in nee mice with mutation of Sh3pxd2b. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2679-2688 (2011).
  8. John, S. W., et al. Essential iris atrophy, pigment dispersion, and glaucoma in DBA/2J mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (6), 951-962 (1998).
  9. Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Ocular hypertension in mice with a targeted type I collagen mutation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (4), 1581-1585 (2003).
  10. Chou, T. H., Tomarev, S., Porciatti, V. Transgenic mice expressing mutated Tyr437His human myocilin develop progressive loss of retinal ganglion cell electrical responsiveness and axonopathy with normal iop. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (9), 5602-5609 (2014).
  11. vander Zypen, E. Experimental morphological study on structure and function of the filtration angel of the rat eye. Ophthalmologica. 174 (5), 285-298 (1977).
  12. Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Aqueous humor dynamics in mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5168-5173 (2003).
  13. Morrison, J. C., Fraunfelder, F. W., Milne, S. T., Moore, C. G. Limbal microvasculature of the rat eye. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 751-756 (1995).
  14. Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64 (1), 85-96 (1997).
  15. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: A paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (1), 207-216 (2010).
  16. Zhu, M. D., Cai, F. Y. Development of experimental chronic intraocular hypertension in the rabbit. Australian and New Zealand Journal of Ophthalmology. 20 (3), 225-234 (1992).
  17. Shareef, S. R., Garcia-Valenzuela, E., Salierno, A., Walsh, J., Sharma, S. C. Chronic ocular hypertension following episcleral venous occlusion in rats. Experimental Eye Research. 61 (3), 379-382 (1995).
  18. Levkovitch-Verbin, H., et al. Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (2), 402-410 (2002).
  19. Zhao, D., et al. Characterization of the Circumlimbal Suture Model of Chronic IOP Elevation in Mice and Assessment of Changes in Gene Expression of Stretch Sensitive Channels. Frontiers in Neuroscience. 11, (2017).
  20. Biswas, S., Wan, K. H. Review of rodent hypertensive glaucoma models. Acta Ophthalmologica. 97 (3), 331-340 (2019).
  21. Pitha, I., et al. Sustained Dorzolamide Release Prevents Axonal and Retinal Ganglion Cell Loss in a Rat Model of IOP-Glaucoma. Translational Vision Science & Technology. 7 (2), 13 (2018).
  22. Grozdanic, S. D., et al. Temporary elevation of the intraocular pressure by cauterization of vortex and episcleral veins in rats causes functional deficits in the retina and optic nerve. Experimental Eye Research. 77 (1), 27-33 (2003).
  23. Lani, R., et al. A subacute model of glaucoma based on limbal plexus cautery in pigmented rats. Scientific Reports. 9 (1), 16286 (2019).
  24. vander Merwe, E. L., Kidson, S. H. The three-dimensional organisation of the post-trabecular aqueous outflow pathway and limbal vasculature in the mouse. Experimental Eye Research. 125, 226-235 (2014).
  25. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).
  26. Sasovetz, D. Ketamine hydrochloride: an effective general anesthetic for use in electroretinography. Annals of Ophthalmology. 10 (11), 1510-1514 (1978).
  27. Stabio, M. E., et al. A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space. The Journal of Comparative Neurology. 526 (11), 1749-1759 (2018).
  28. Blanco, R., et al. A Chronic Ocular-Hypertensive Rat Model induced by Injection of the Sclerosant Agent Polidocanol in the Aqueous Humor Outflow Pathway. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3209 (2019).
  29. Paranhos, A., Prata, J. A., de Mello, P. A., da Silva, F. A. Post-Trabecular Glaucomas with Elevated Episcleral Venous Pressure. Mechanisms of the Glaucomas. , 139-157 (2008).
  30. Ou, Y., Jo, R. E., Ullian, E. M., Wong, R. O. L., Della Santina, L. Selective Vulnerability of Specific Retinal Ganglion Cell Types and Synapses after Transient Ocular Hypertension. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of The Society for Neuroscience. 36 (35), 9240-9252 (2016).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Lani-Louzada, R., Abreu, C. A., Araújo, V. G., Dias, M. S., Petrs-Silva, H., Linden, R. Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents. J. Vis. Exp. (180), e63442, doi:10.3791/63442 (2022).

View Video