식물 기생 선충류 Ditylenchus dipsaci 배양 및 스크리닝

본 연구에 사용된 D. dipsaci 균주 G-137은 프린스 에드워드 카운티의 Fish Lake 4 Variety 마늘에서 수집되었으며 캐나다 농업 및 농식품 캐나다에서 제공했습니다. 신선한 문화를 시작하는 경우, 접종 방법론15에 대해서는 Poirier et al.을 참조하십시오. 1. D. 딥사시의 배양 이전에 보고된 작업15에 따라 미디어와 플레이트를 준비한다. 500 mL의 영양 한천 (NA) 배지를 23 g / L의 NA ( 재료 표 참조) 및 초순수로 준비하십시오. 멸균 기술을 사용하여 오토클레이브 NA 배지 25mL를 일회용 페트리 접시 20개(직경 100mm x 깊이 15mm)에 붓습니다. 한천이 ~2시간 동안 뚜껑을 켠 상태에서 실온(22°C)에서 응고되도록 허용하고 나중에 사용할 수 있도록 따로 보관합니다. 최소 유기물이 있는 3.2 g/L의 GA 기본 배지, 20 g/L의 수크로오스, 15 g/L의 한천 및 증류수를 포함하는 Gamborg B-5 (GA) 배지 500 mL를 준비하십시오 ( 자료 표 참조). 멸균 기술을 사용하여 오토클레이브 GA 배지 50mL를 일회용 페트리 접시 10개(직경 100mm x 깊이 25mm)에 붓습니다. 한천이 뚜껑을 켠 상태에서 실온(22°C)에서 응고되도록 ~5시간 동안 방치하고, 새싹이 옮겨질 때까지 멸균 백에 실온에서 똑바로 보관한다.참고: 과도한 미디어 플레이트는 오염이 발생할 경우 만들어집니다. 이전 작업15에서 수정 된 방법에 따라 종자 살균을 수행하십시오. 2 L 비이커 1개를 교반 바, 2 포셉, 유리 페트리 접시 및 증류수 1 L로 오토클레이브합니다. 95% EtOH 용액 200mL와 15% 상업용 표백제 용액 200mL를 준비한다. 완두콩 씨앗을 사용하십시오 ( 재료 표 참조). 실험실 벤치의 Bunsen 버너 불꽃 근처의 교반 막대가있는 멸균 된 2L 비커에 150 개의 씨앗을 붓습니다. 비이커 내의 종자에 95% EtOH 200 mL를 첨가하고, 교반 플레이트에서 5분 동안 격렬하게 저어준 다음, 폐기물 용기에 EtOH를 붓는다. 표백제 용액을 비커에 부어 씨앗을 완전히 담그십시오. 교반 접시에서 20 분 동안 격렬하게 저어 준 다음 표백제를 폐기물 용기에 붓습니다. 비커에 증류수를 붓고 씨앗을 담그고 20 분 동안 교반 접시에 격렬하게 저어줍니다. 물 세척을 세 번 반복하고 각 세척 후 증류수를 붓습니다. 마지막 물 세척 후, 유리 페트리 접시에 살균 된 씨앗을 붓는다. 오염을 확인하기 위해, 멸균된 포셉을 사용하여 층류 홍수 후드의 각 10cm NA 플레이트(단계 1.1.1에서 제조)에 6개의 종자를 옮깁니다. 접시의 둘레 주위에 씨앗을 배열하십시오 (깃털 씨앗이 가장 잘 작동합니다). 플레이트를 실험실 랩핑 필름에 개별적으로 감싸고 26°C에서 3일 동안 어둠 속에서 인큐베이션한다.참고 : 필요한 것보다 더 많은 씨앗을 도금하면 오염되지 않은 씨앗을 선택적으로 사용할 수 있습니다. 아래 단계에 따라 새싹 전달을 수행하십시오. 층류 후드에서 멸균된 포셉을 사용하여 각 GA 플레이트에 오염되지 않은 종자 2개를 플레이트에 플레이트합니다(단계 1.1.2에서 준비). 플레이트를 실험실 래핑 필름에 개별적으로 감싸고 종자가 싹을 틔울 수 있도록 실온에서 7-10 일 동안 배양하십시오. 이전 작업(15)으로부터 수정된 방법에 따라 시험관내 사육을 수행한다. 20 g/L 수크로오스 용액 50 mL를 준비한다. 필터는 수크로오스 용액을 멸균하고 따로 보관하십시오. 층류 후드에서 뿌리 조직 (~2cm3)을 함유 한 한천 조각을 기존 배양 접시에서 자릅니다. 완두콩 묘목이있는 새로운 GA 플레이트에 수크로오스 용액 500 μL를 피펫하고 수크로오스 위에 한천 큐브를 놓습니다. 플레이트를 실험실 래핑 필름에 개별적으로 감싸고 실온에서 알루미늄 호일로 늘어선 상자에서 배양물을 유지한다 (∼22°C). 배양을 유지하기 위해 8-9주마다 신선한 GA 플레이트 상에 선충류를 계대배양한다. 선충류는 ~ 8 주 후에 추출 될 준비가되었습니다. 2. D. dipsaci의 추출 및 수집 아래 단계에 따라 D. dipsaci 의 추출을 수행하십시오. 50mL 비이커, 80mm 깔때기, 150mL 증류수 및 커피 필터를 오토클레이브합니다. 깔때기를 비커에 넣고 깔때기를 멸균 커피 필터로 정렬하십시오. 층류 후드에서 멸균 메스를 사용하여 한천과 뿌리 조직을1cm3 로 자릅니다. 한천 큐브를 커피 필터가 늘어선 깔때기로 옮기고 한천에 증류수를 천천히 부어 커피 필터를 적셔줍니다. 비이커에서 커피 필터가 늘어선 깔때기를 제거하고 커피 필터가 늘어선 깔때기를 교체하면 수위가 필터 바닥에 닿을 때까지 비이커를 증류수로 채 웁니다. 커피 필터가 늘어선 깔때기와 비커를 알루미늄 호일로 덮으십시오. 웜이 커피 필터를 통해 수집 비커로 이동할 수 있도록 벤치 탑에 하룻밤 (16 시간) 두십시오.참고 : 선충류 배양 플레이트는 해부 현미경으로 검사 할 때 웜이 한천으로 기어 들어갔을 때 추출 할 준비가되었습니다. 전형적으로, 플레이트는 초기 접종 후 6-8 주 후에 추출 준비됩니다. D. dipsaci의 수집을 수행하십시오.참고 : 다음날 D. dipsaci 웜은 비커의 바닥에 정착 할 것입니다. 커피 필터 라이닝된 깔때기를 제거하고 수집 비이커로부터 최고 40 mL의 물을 흡인하고; 정착 된 웜을 방해하지 않도록하십시오. 10 mL 플라스틱 혈청학적 피펫을 사용하여, 남아있는 액체를 15 mL 원뿔형 원심분리 튜브에 수집한다.참고: 이 컬렉션은 분석에서 직접 사용할 수 있습니다. 24시간 이내에 사용하지 않을 경우 4°C에 둔다. 웜은 이동성에 눈에 띄는 영향없이 4 °C에서 3 일 동안 방치 할 수 있습니다. 깔때기를 제거하면 수집 비커의 웜이 방해받을 수 있습니다. 수집하기 전에 바닥에 정착하게하십시오. 3. 시험관내 소분자화 하기 단계에 따라 분석 플레이트를 준비한다. 오토클레이브 증류수를 멸균 트로프에 붓고, 다채널 피펫을 사용하여, 골짜기로부터 증류수 40 μL를 평평한 바닥 96-웰 플레이트의 각 웰에 분주한다. 고정 도구 준비 및 화학 물질 추가 실험실 벤치의 Bunsen 버너 불꽃 근처에 피너 트레이( 재료 표 참조)를 설치하십시오. 연속 피너 트레이에 다음을 추가합니다: 핀 세척 용액 25 mL, 50% DMSO 35 mL(물 중), 증류수 45 mL, 70% EtOH 55 mL, 95% EtOH 65 mL. 블롯팅 용지 한 장을 각 트레이 앞에 놓습니다. 세척 용액의 핀을 에머징하고 용액에서 핀을 위아래로 3회(3배) 이동시켜 고정 도구를 청소합니다. 이 프로토콜에서 ‘3x’와 ’10x’는 솔루션에서 피너를 각각 세 번 또는 10 번 위아래로 움직이는 것으로 정의됩니다. 블롯팅 용지에 핀을 블롯합니다. 이 절차를 한 번 더 반복하십시오. 다음으로, 핀을 증류수에서 3x 헹구고 핀을 블롯팅합니다. 이 절차를 한 번 더 반복하십시오. 마지막으로 핀을 95% EtOH로 3배 헹구고 핀을 블롯팅합니다. 한 번 더 반복하십시오. 피너를 화염시키고 에탄올이 증발하도록하십시오. 96웰 화학 스톡 플레이트의 화학 물질을 화학 플레이트에 3x를 고정한 다음 핀 10X를 분석 플레이트로 옮겨 분석 플레이트에 추가합니다. 세척 용액 앞의 종이에 닦으십시오. 블롯팅 용지에서 그 사이에 블롯팅하여 다음 순서로 세척하여 플레이트 사이의 고정 도구를 청소하십시오 : 50 % DMSO (한 번), 증류수에서 3x (한 번), 75 % EtOH에서 3x (한 번), 95 % EtOH에서 3x (두 번). 피너를 화염시키고 에탄올이 증발하도록하십시오. 모든 고정이 완료되면 3.2.2단계를 반복합니다.주: 스크리닝은 60 μM의 최종 농도에서 수행되었다. 웜 추가 먼저 재현탁 한 다음 관찰을 위해 슬라이드에 낮은 보존 팁을 사용하여 5 μL를 피펫팅하여 수집에서 선충류의 수를 계산하십시오. 해부 현미경을 사용하여 5 μL의 선충류의 수를 계산하십시오. 멸균 증류수를 사용하여 농도를 2 웜 / μL로 조정하십시오. 다중 채널 피펫과 골짜기를 사용하여 96웰 플레이트의 각 웰에 10μL(~20개의 웜)를 추가합니다.주: 대략 15,000 D. 딥사시 선충류는 기술된 배양 및 수집 방법을 사용하여 배양 플레이트 당 수집될 것이다. 스무 개의 웜이 우물 당 사용되는데, 그 이유는 작은 수가 모바일 및 움직이지 않는 웜의 명확한 시각화와 회계를 용이하게하기 때문입니다. 실험실 포장 필름에 접시를 밀봉하고 젖은 종이 타월로 감싸십시오. 박스에 넣고 200 rpm으로 설정된 20°C 진탕 배양기에서 끈적끈적한 패드에 부착한다. 접시의 움직임을 최소화하기 위해 여분의 축축한 종이 타월을 추가하여 접시가 상자에서 안정화되도록하십시오. 4. 데이터 수집 및 분석 해부 현미경으로 5 일째에 접시를 관찰하십시오. DMSO 용매 대조군 및 약물 처리 웰에서 D. dipsaci 의 이동 수 및 총 수를 계수한다. 웜이 비교적 움직이지 않는 경우, 2 μL의 1 M NaOH를 40 mM의 최종 농도로 웰에 첨가하여19,20의 이동을 자극한다.참고 : NaOH를 추가 한 후 웜은 즉시 움직이며 5 분 이내에 볼 필요가 있습니다. 모바일 웜의 수와 웜의 총 수는 모바일 웜의 비율을 계산하는 데 사용됩니다. 분석의 길이는 스크린의 목적에 따라 변경될 수 있다. 모바일 웜의 비율을 계산합니다. D. dipsaci 스크린에서는 재현 가능하게 0 % 모바일 웜을 산출 한 웰이 강력한 히트로 분류됩니다.참고 : 해부 현미경 단계에서 플레이트의 장시간 노출은 광원이 플레이트를 가열하고 생물 분석에 대한 다양한 효과를 유도 할 수 있기 때문에 피할 수 있습니다.