Özet

Förster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features

Published: March 16, 2022
doi:

Özet

El estudio detalla la metodología del mapeo FRET, incluida la selección de sitios de etiquetado, la elección de tintes, la adquisición y el análisis de datos. Esta metodología es efectiva para determinar los sitios de unión, los cambios conformacionales y los movimientos dinámicos en los sistemas de proteínas y es más útil si se realiza junto con la información estructural 3D existente.

Abstract

La transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) es un método establecido basado en la fluorescencia utilizado para medir con éxito las distancias en y entre las biomoléculas in vitro, así como dentro de las células. En FRET, la eficiencia de la transferencia de energía, medida por los cambios en la intensidad de la fluorescencia o la vida útil, se relaciona con la distancia entre dos moléculas fluorescentes o etiquetas. La determinación de la dinámica y los cambios conformacionales a partir de las distancias son solo algunos ejemplos de las aplicaciones de este método a los sistemas biológicos. Bajo ciertas condiciones, esta metodología puede agregar y mejorar las estructuras cristalinas de rayos X existentes al proporcionar información sobre la dinámica, la flexibilidad y la adaptación a las superficies de unión. Describimos el uso de FRET y las determinaciones de distancia asociadas para dilucidar las propiedades estructurales, a través de la identificación de un sitio de unión o las orientaciones de las subunidades de dímeros. A través de la elección juiciosa de los sitios de etiquetado y, a menudo, el empleo de múltiples estrategias de etiquetado, hemos aplicado con éxito estos métodos de mapeo para determinar las propiedades estructurales globales en un complejo proteína-ADN y el sistema de translocación de proteínas SecA-SecYEG. En el sistema SecA-SecYEG, hemos utilizado métodos de mapeo FRET para identificar el sitio de unión a preproteínas y determinar la conformación local de la región de secuencia de señales unidas. Este estudio describe los pasos para realizar estudios de mapeo FRET, incluida la identificación de sitios de etiquetado apropiados, la discusión de posibles etiquetas, incluidos los residuos de aminoácidos no nativos, los procedimientos de etiquetado, cómo realizar mediciones e interpretar los datos.

Introduction

Para las proteínas, la elucidación de la dinámica junto con el conocimiento estructural tridimensional (3-D) conduce a una mejor comprensión de las relaciones estructura-función de los sistemas biomoleculares. Los métodos estructurales, como la cristalografía de rayos X y la microscopía electrónica criogénica, capturan una estructura estática y, a menudo, requieren la determinación de múltiples estructuras para dilucidar aspectos de la unión y dinámica de biomoléculas1. En este artículo se describe un método basado en soluciones para mapear elementos estructurales globales, como sitios de enlace o interacciones de enlace, que son potencialmente más transitorios y menos fáciles de capturar mediante métodos estáticos. Los sistemas candidatos fuertes para esta metodología son aquellos en los que una estructura 3-D ha sido previamente determinada por cristalografía de rayos X, espectroscopia de RMN u otros métodos estructurales. En este caso, aprovechamos la estructura cristalina de rayos X del complejo SecA-SecYEG, un actor central en la vía secretora general de la proteína, para mapear la ubicación de un sitio de unión al péptido señal utilizando la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) antes del transporte de la preproteína a través de la membrana2. La manipulación del sistema biológico a través de modificaciones genéticas junto con nuestro conocimiento de la estructura 3-D permitió la determinación de la conformación de la secuencia de señal y la región madura temprana inmediatamente antes de la inserción en el canal 3.

FRET implica la transferencia de energía sin radiación de una molécula (donante) a otra (aceptor) de una manera dependiente de la distancia que es a través del espacio 4,5. La eficiencia de esta transferencia se controla a través de una disminución en el donante o un aumento en la intensidad de la fluorescencia del aceptor. La eficiencia de la transferencia de energía se puede describir como

E = R06/(R06 + R6)

en el que el valor R0 es la distancia a la que la transferencia es 50% eficiente6. La técnica ha sido descrita previamente como una regla molecular y es efectiva para determinar distancias en el rango de 2.5-12 nm, dependiendo de la identidad de los colorantes donante-aceptor 4,7,8,9. Las intensidades de fluorescencia del donante y las vidas útiles con o sin aceptor permiten determinar las eficiencias de transferencia y, en consecuencia, las distancias 5,8. Debido a la disponibilidad de la tecnología, la sensibilidad del método y la facilidad de uso, FRET también ha encontrado una amplia aplicación en áreas como la espectroscopia de fluorescencia de molécula única y la microscopía confocal6. El advenimiento de proteínas fluorescentes como la proteína fluorescente verde ha hecho que la observación de la dinámica intracelular y las imágenes de células vivas sean relativamentefáciles 10,11. Muchas aplicaciones FRET como estas se discuten en detalle en este número virtual.

En este estudio, nos centramos particularmente en el uso de mediciones FRET para obtener valores de distancia para determinar detalles estructurales. Anteriormente, las mediciones de FRET se han utilizado eficazmente para determinar la conformación de las moléculas de ADN cuando se unen a la proteína 12,13,14, la dinámica interna de las proteínas y las interacciones de unión a proteínas 15,16,17. Las ventajas de este método radican en la capacidad de determinar elementos estructurales flexibles y dinámicos en una solución con cantidades relativamente bajas de material. Significativamente, este método es particularmente efectivo cuando se usa junto con la información estructural existente y no se puede usar como un medio de determinación de la estructura 3D. El método proporciona la mejor visión y refinamiento de la estructura si el trabajo se basa en la información estructural existente a menudo junto con la simulación computacional18,19. Aquí, se describe el uso de distancias obtenidas de mediciones FRET en estado estacionario y resueltas en el tiempo para mapear un sitio de unión, cuya ubicación no se conocía, en una estructura cristalográfica existente del complejo SecA-SecYEG, proteínas principales en la vía secretora general3.

La vía secretora general, un sistema altamente conservado desde procariotas hasta eucariotas y arqueas, media el transporte de proteínas a través o dentro de la membrana a su ubicación funcional en la célula. Para las bacterias Gram-negativas, como E. coli, el organismo utilizado en nuestro estudio, las proteínas se insertan o translocan a través de la membrana interna hasta el periplasma. El complejo del canal SecY bacteriano (denominado translocon) se coordina con otras proteínas para translocar la proteína recién sintetizada, que se dirige a su ubicación correcta en la célula a través de una secuencia de señal típicamente ubicada en el extremo N20,21. Para las proteínas unidas al periplasma, la proteína ATPasa SecA se asocia con el túnel de salida del ribosoma, y con la preproteína después de que se hayan traducido aproximadamente 100 residuos22. Junto con la proteína chaperona SecB, mantiene la preproteína en un estado desplegado. SecA se une al translocón SecYEG, y a través de muchos ciclos de hidrólisis de ATP, facilita el transporte de proteínas a través de la membrana23,24.

SecA es una proteína multidominio que existe en formas citosólicas y unidas a la membrana. Una proteína homodimérica en el citosol, SecA consiste en un dominio de unión preproteica o de reticulación25, dos dominios de unión a nucleótidos, un dominio de ala helicoidal, un dominio de andamio helicoidal y el dedo de dos hélices (THF)26,27,28,29 (Figura 1). En estudios cristalográficos previos del complejo SecA-SecYEG, la ubicación del THF sugirió que participaba activamente en la translocación de proteínas y los experimentos posteriores de reticulación con el péptido señal establecieron aún más la importancia de esta región en la translocación de proteínas30,31. Estudios previos, utilizando la metodología de mapeo FRET, demostraron que los péptidos señal exógenos se unen a esta región de SecA 2,32. Para comprender completamente la conformación y la ubicación de la secuencia de señal y la región madura temprana de la preproteína antes de la inserción en el canal SecYEG, se creó una quimera de proteínas en la que la secuencia de señales y los residuos de la región madura temprana se unieron a SecA a través de un enlazador Ser-Gly (Figura 1). Utilizando esta construcción biológicamente viable, se demostró además que la secuencia de señales y la región madura temprana de la preproteína se unen al THF de manera paralela2. Posteriormente, se utilizó la metodología de mapeo FRET para dilucidar la conformación y localización de la secuencia de señales y la región madura temprana en presencia de SecYEG como se describe a continuación3.

El conocimiento de la estructura 3-D del complejo SecA-SecYEG 33,34,35 y la posible ubicación del sitio de unión nos permitió colocar juiciosamente etiquetas donante-aceptor en lugares donde la intersección de distancias FRET individuales identifica la ubicación del sitio de unión. Estas mediciones de mapeo FRET revelaron que la secuencia de señales y la región madura temprana de la preproteína forman una horquilla con la punta ubicada en la boca del canal SecYEG, lo que demuestra que la estructura de la horquilla se modela antes de la inserción del canal.

Protocol

1. Selección de sitios de etiquetado Identifique al menos tres posibles sitios de etiquetado para triangular el supuesto sitio de unión en las estructuras proteicas existentes. En este caso, se identificaron SecA, SecYEG y preproteína unida a SecA a través de la fusión genética2. Elija sitios de etiquetado dentro de 25-75 Å del sitio de unión putativo y en regiones relativamente estáticas de la proteína, la distancia determinará el par de tinte FRET es…

Representative Results

Este estudio se centró en determinar la ubicación del sitio de unión a la preproteína en SecA antes de la inserción de la preproteína en el canal SecYEG. Para mapear el sitio de unión, se realizaron experimentos FRET entre diferentes regiones de la preproteína y tres ubicaciones distintas en las proteínas SecA y SecYEG (Figura 1A-D). A partir de las distancias obtenidas y las estructuras tridimensionales de SecA, SecYEG y la preproteína, se predijo…

Discussion

Mediante el uso de la metodología de mapeo FRET, identificamos el sitio de unión a la secuencia de señales en la proteína SecA. Es importante destacar que la presencia de una estructura cristalina 3D del complejo facilitó enormemente nuestro estudio. La fortaleza de esta metodología de mapeo radica en la capacidad de utilizar una estructura existente para identificar ubicaciones para el etiquetado. Esta metodología no se puede utilizar para determinar una estructura 3D; sin embargo, la determinación de elementos …

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la subvención R15GM135904 de los Institutos Nacionales de Salud (otorgada a IM) y la Subvención GM110552 de los Institutos Nacionales de Salud (otorgada a DBO).

Materials

490 nm LED laser Horiba 1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne Life Technologies A20347
Agar Difco DF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne Life Technologies A10254
Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne Life Technologies S10904
Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne Life Technologies S10906
Amicon Ultra­4 Centrifugal filter (50kDa MWCO) Sigma UFC805008
Dodecylmaltoside (DDM) Anatrace D310
E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
extended signal peptide SP41 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
FluorEssence Horiba version 2.4 spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer
Fluoromax 4 spectrofluorometer Horiba N/A
GlobalsWE Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine spectral analysis program for time-resolved decays
H­4­Azido­Phe­OH BACHEM 4020250.0001
LB (Miller) Broth Fisher Scientific BP9723
Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O) Sigma-Aldrich 420816 dilution is needed to make a proper scattering solution
PTI Felix GX Horiba version 4.1.0.4096 spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument
PTI Time Master Instrument Horiba NA
Pymol Molecular Graphics Program Schrodinger version 2.4
Water bath Thermo Scientific NESLAB RTE 10

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Bu Makaleden Alıntı Yapın
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