福斯特共振能量转移映射：阐明全球结构特征的新方法

对于蛋白质，动力学的阐明以及3维（3-D）结构知识可以增强对生物分子系统的结构 – 功能关系的理解。结构方法，如X射线晶体学和低温电子显微镜，捕获静态结构，并且通常需要确定多个结构以阐明生物分子结合和动力学的各个方面¹。本文讨论了一种基于解决方案的方法来映射全局结构元素，例如结合位点或结合相互作用，这些元素可能更短暂，并且不容易被静态方法捕获。这种方法的强候选系统是先前已通过X射线晶体学，NMR光谱或其他结构方法确定3-D结构的系统。在这种情况下，我们利用SecA-SecYEG复合物的X射线晶体结构（蛋白质一般分泌途径中的核心参与者），在前蛋白穿过膜²之前，使用Förster共振能量转移（FRET）绘制信号肽结合位点的位置。通过基因修饰对生物系统的操纵加上我们对3-D结构的了解，使得能够在插入通道 ³之前立即确定信号序列和早期成熟区域的构象。

FRET涉及能量从一个分子（供体）到另一个分子（受体）的无辐射转移，其距离依赖性方式是通过空间^4，5。通过供体的减少或受体荧光强度的增加来监测这种转移的效率。能量传递的效率可谓

E = R₀⁶/（R₀⁶ + R⁶）

其中 R₀ 值是传输效率为 50% 的距离⁶。该技术以前被描述为分子尺，并且根据供体 – 受体染料^4，7，⁸，⁹的身份，有效地确定2.5-12nm范围内的距离。使用或不使用受体的供体荧光强度和寿命允许确定转移效率，因此距离^为5，8。由于该技术的可用性，该方法的灵敏度和易用性，FRET在单分子荧光光谱和共聚焦显微镜⁶等领域也得到了广泛的应用。荧光蛋白（如绿色荧光蛋白）的出现使得细胞内动力学和活细胞成像的观察相对容易^10，11。许多 FRET 应用程序（如此类）将在此虚拟问题中详细讨论。

在这项研究中，我们特别关注使用FRET测量来产生距离值以确定结构细节。以前，FRET测量已被有效地用于确定DNA分子在与蛋白质^12，13，14结合时的构象，蛋白质的内部动力学以及蛋白质结合相互作用^15，16，17。这种方法的优点在于能够确定具有相对较少材料量的溶液中的柔性和动态结构单元。值得注意的是，当与现有结构信息结合使用时，这种方法特别有效，不能用作3-D结构测定的手段。如果工作建立在现有的结构信息之上，并且通常与计算仿真^18，19相结合，则该方法可提供最佳的结构洞察力和细化。在这里，描述了使用从稳态和时间分辨的FRET测量中获得的距离来绘制结合位点，其位置尚不清楚，在SecA-SecYEG复合物的现有晶体结构上，主要蛋白质在一般分泌途径³中。

一般分泌途径是一种高度保守的系统，从原核生物到真核生物再到古菌，介导蛋白质穿过或进入膜到其在细胞中的功能位置的运输。对于革兰氏阴性菌，例如我们研究中使用的生物体 大肠杆菌 ，蛋白质入或穿过内膜转移到周质。细菌SecY通道复合物（称为转座蛋白）与其他蛋白质协调以转移新合成的蛋白质，该蛋白质通过通常位于N端^20，21的信号序列被引导到其在细胞中的正确位置。对于与围质结合的蛋白质，ATPase SecA蛋白与核糖体的出口隧道相关，并且在翻译了大约100个残基²²个后与前蛋白相关。与SecB伴侣蛋白一起，它将前蛋白维持在未折叠状态。SecA与SecYEG转座结合，并通过ATP水解的许多循环，促进蛋白质在膜上的转运^23，24。

SecA是一种多结构域蛋白，以胞质和膜结合形式存在。SecA是细胞质基质中的同源二甲基蛋白，由前蛋白结合或交联结构域²⁵，两个核苷酸结合结构域，螺旋翼结构域，螺旋支架结构域和两个螺旋指（THF）^{26，27，28，29} 组成（图1）。在先前对SecA-SecYEG复合物的晶体学研究中，THF的位置表明它积极参与蛋白质易位，随后与信号肽的交联实验进一步确定了该区域在蛋白质易位^30，31中的重要性。先前使用FRET映射方法的研究表明，外源信号肽与SecA^2，32的该区域结合。为了在插入SecYEG通道之前充分了解信号序列的构象和位置以及前蛋白的早期成熟区域，创建了一种蛋白质嵌合体，其中通过Ser-Gly连接子将早期成熟区域的信号序列和残基连接到SecA（图1）。使用这种生物学上可行的结构，进一步证明前蛋白的信号序列和早期成熟区域以平行的方式与THF结合²。随后，使用FRET映射方法阐明了在SecYEG存在下信号序列和早期成熟区域的构象和位置，如下^所述3。

了解SecA-SecYEG复合物^33，34，35的^3-D结构和结合位点的可能位置，使我们能够明智地将供体 – 受体标签放置在各个FRET距离的交集识别结合位点位置的位置。这些FRET映射测量表明，信号序列和前蛋白的早期成熟区域形成发夹，尖端位于SecYEG通道的口，表明发夹结构在通道插入之前是模板化的。