رسم خرائط نقل الطاقة بالرنين Förster: منهجية جديدة لتوضيح الميزات الهيكلية العالمية
Özet
تفصل الدراسة منهجية رسم خرائط FRET بما في ذلك اختيار مواقع وضع العلامات ، واختيار الأصباغ ، والاقتناء ، وتحليل البيانات. هذه المنهجية فعالة في تحديد مواقع الربط ، والتغيرات التوافقية ، والحركات الديناميكية في أنظمة البروتين وهي مفيدة للغاية إذا تم تنفيذها بالاقتران مع المعلومات الهيكلية 3-D الحالية.
Abstract
نقل طاقة الرنين Förster (FRET) هي طريقة راسخة قائمة على التألق تستخدم لقياس المسافات بنجاح في الجزيئات الحيوية وبينها في المختبر وكذلك داخل الخلايا. في FRET ، ترتبط كفاءة نقل الطاقة ، التي تقاس بالتغيرات في شدة التألق أو العمر الافتراضي ، بالمسافة بين جزيئين أو ملصقات فلورية. إن تحديد الديناميكيات والتغيرات التوافقية من المسافات ليست سوى بعض الأمثلة على تطبيقات هذه الطريقة على الأنظمة البيولوجية. في ظل ظروف معينة ، يمكن لهذه المنهجية أن تضيف إلى الهياكل البلورية الحالية للأشعة السينية وتعززها من خلال توفير معلومات تتعلق بالديناميكيات والمرونة والتكيف مع الأسطح الملزمة. نحن نصف استخدام FRET وتحديد المسافة المرتبطة به لتوضيح الخصائص الهيكلية ، من خلال تحديد موقع ربط أو اتجاهات الوحدات الفرعية dimer. من خلال الاختيار الحكيم لمواقع وضع العلامات ، وغالبا ما نستخدم استراتيجيات متعددة لوضع العلامات ، نجحنا في تطبيق طرق رسم الخرائط هذه لتحديد الخصائص الهيكلية العالمية في مجمع البروتين والحمض النووي ونظام نقل البروتين SecA-SecYEG. في نظام SecA-SecYEG ، استخدمنا طرق رسم خرائط FRET لتحديد موقع ربط ما قبل البروتين وتحديد التشكيل المحلي لمنطقة تسلسل الإشارة المرتبطة. تحدد هذه الدراسة خطوات إجراء دراسات رسم الخرائط FRET ، بما في ذلك تحديد مواقع وضع العلامات المناسبة ، ومناقشة الملصقات المحتملة بما في ذلك بقايا الأحماض الأمينية غير الأصلية ، وإجراءات وضع العلامات ، وكيفية إجراء القياسات ، وتفسير البيانات.
Introduction
بالنسبة للبروتينات ، يؤدي توضيح الديناميكيات إلى جانب المعرفة الهيكلية ثلاثية الأبعاد (3-D) إلى فهم معزز للعلاقات بين البنية والوظيفة للأنظمة الجزيئية الحيوية. تلتقط الطرق الهيكلية ، مثل علم البلورات بالأشعة السينية والمجهر الإلكتروني المبرد ، بنية ثابتة وغالبا ما تتطلب تحديد هياكل متعددة لتوضيح جوانب ربط الجزيئات الحيوية وديناميكياتها1. تتناول هذه المقالة طريقة قائمة على الحلول لتعيين العناصر الهيكلية العالمية، مثل مواقع الربط أو تفاعلات الربط، التي يحتمل أن تكون أكثر عابرة وأقل سهولة في التقاطها بواسطة الطرق الثابتة. الأنظمة المرشحة القوية لهذه المنهجية هي تلك التي تم فيها تحديد بنية 3-D مسبقا بواسطة علم البلورات بالأشعة السينية أو التحليل الطيفي للرنين المغناطيسي النووي أو الطرق الهيكلية الأخرى. في هذه الحالة ، نستفيد من البنية البلورية للأشعة السينية لمجمع SecA-SecYEG ، وهو لاعب مركزي في مسار الإفراز العام للبروتين ، لرسم خريطة لموقع ربط ببتيد الإشارة باستخدام نقل طاقة الرنين Förster (FRET) قبل نقل البروتين المسبق عبر الغشاء2. إن التلاعب بالنظام البيولوجي من خلال التعديلات الجينية إلى جانب معرفتنا بالبنية ثلاثية الأبعاد مكن من تحديد تشكيل تسلسل الإشارة والمنطقة الناضجة المبكرة مباشرة قبل إدخالها في القناة 3.
يتضمن FRET نقل الطاقة بدون إشعاع من جزيء واحد (مانح) إلى آخر (متقبل) بطريقة تعتمد على المسافة التي تتم عبر الفضاء 4,5. يتم رصد كفاءة هذا النقل إما من خلال انخفاض في المتبرع أو زيادة في كثافة التألق المتقبل. يمكن وصف كفاءة نقل الطاقة بأنها
E = R 0 6/(R0 6 + R 6)
حيث تكون قيمة R0 هي المسافة التي يكون فيها النقل فعالا بنسبة 50٪6. وقد وصفت هذه التقنية سابقا بأنها مسطرة جزيئية وهي فعالة في تحديد المسافات في نطاق 2.5-12 نانومتر، اعتمادا على هوية الأصباغ المتقبلة المانحة4،7،8،9. تسمح كثافة التألق المانحة وعمرها الافتراضي مع أو بدون المتقبل بتحديد كفاءات النقل وبالتالي ، المسافات 5,8. نظرا لتوافر التكنولوجيا ، وحساسية الطريقة ، وسهولة الاستخدام ، وجدت FRET أيضا تطبيقا واسعا في مجالات مثل التحليل الطيفي الفلوري أحادي الجزيء والمجهر البؤري6. ظهور البروتينات الفلورية مثل بروتين الفلورسنت الأخضر جعل ملاحظة الديناميكيات داخل الخلايا وتصوير الخلايا الحية سهلة نسبيا10,11. تتم مناقشة العديد من تطبيقات FRET مثل هذه بالتفصيل في هذه المشكلة الافتراضية.
في هذه الدراسة ، نركز بشكل خاص على استخدام قياسات FRET لإنتاج قيم المسافة لتحديد التفاصيل الهيكلية. في السابق ، تم استخدام قياسات FRET بشكل فعال لتحديد تكوين جزيئات الحمض النووي عند ارتباطها بالبروتين 12،13،14 ، والديناميات الداخلية للبروتينات ، وتفاعلات ربط البروتين15،16،17. تكمن مزايا هذه الطريقة في القدرة على تحديد العناصر الهيكلية المرنة والديناميكية في حل بكميات منخفضة نسبيا من المواد. بشكل ملحوظ ، هذه الطريقة فعالة بشكل خاص عند استخدامها بالاقتران مع المعلومات الهيكلية الموجودة ولا يمكن استخدامها كوسيلة لتحديد هيكل 3-D. توفر هذه الطريقة أفضل رؤية وصقل للهيكل إذا كان العمل يعتمد على المعلومات الهيكلية الموجودة غالبا ما يقترن بالمحاكاة الحسابية18,19. هنا ، يتم وصف استخدام المسافات التي تم الحصول عليها من قياسات FRET ذات الحالة الثابتة والوقت المحدد لرسم خريطة لموقع ربط ، لم يكن موقعه معروفا ، على بنية بلورية موجودة لمجمع SecA-SecYEG ، البروتينات الرئيسية في مسار الإفراز العام3.
يتوسط مسار الإفراز العام ، وهو نظام محفوظ للغاية من بدائيات النوى إلى حقيقيات النوى إلى العتائق ، نقل البروتينات إما عبر الغشاء أو داخله إلى موقعها الوظيفي في الخلية. بالنسبة للبكتيريا سالبة الجرام ، مثل الإشريكية القولونية ، الكائن الحي المستخدم في دراستنا ، يتم إدخال البروتينات في الغشاء الداخلي أو نقله عبر الغشاء الداخلي إلى periplasm. ينسق مجمع قناة SecY البكتيري (المسمى translocon) مع البروتينات الأخرى لنقل البروتين المركب حديثا ، والذي يتم توجيهه إلى موقعه الصحيح في الخلية من خلال تسلسل إشارة يقع عادة في N-terminus20,21. بالنسبة للبروتينات المرتبطة بالبيريبلازما ، يرتبط بروتين ATPase SecA بنفق خروج الريبوسوم ، ومع البروتين المسبق بعد ترجمة ما يقرب من 100 بقايا22. جنبا إلى جنب مع بروتين SecB chaperone ، فإنه يحافظ على البروتين المسبق في حالة غير مطوية. يرتبط SecA ب SecYEG translocon ، ومن خلال العديد من دورات التحلل المائي ATP ، يسهل نقل البروتين عبر الغشاء23,24.
SecA هو بروتين متعدد المجالات موجود في أشكال الخلايا والمرتبطة بالغشاء. بروتين متجانس في السيتوسول ، يتكون SecA من مجال ربط ما قبل البروتين أو الربط المتقاطع25 ، ومجالين مرتبطين بالنيوكليوتيدات ، ومجال جناح حلزوني ، ومجال سقالة حلزونية ، وإصبعين حلزوني (THF) 26،27،28،29 (الشكل 1). في الدراسات البلورية السابقة لمجمع SecA-SecYEG ، اقترح موقع THF أنه شارك بنشاط في نقل البروتين والتجارب اللاحقة للربط المتبادل مع ببتيد الإشارة ، مما زاد من أهمية هذه المنطقة في نقل البروتين30,31. أظهرت الدراسات السابقة ، باستخدام منهجية رسم الخرائط FRET ، أن ببتيدات الإشارة الخارجية ترتبط بهذه المنطقة من SecA 2,32. لفهم كامل لتكوين وموقع تسلسل الإشارة والمنطقة الناضجة المبكرة للبروتين المسبق قبل إدخاله في قناة SecYEG ، تم إنشاء وهم البروتين الذي تم فيه ربط تسلسل الإشارة وبقايا المنطقة الناضجة المبكرة ب SecA من خلال رابط Ser-Gly (الشكل 1). باستخدام هذا البناء القابل للحياة بيولوجيا ، ثبت كذلك أن تسلسل الإشارة والمنطقة الناضجة المبكرة من البروتين المسبق ترتبط ب THF بطريقة متوازية2. وفي وقت لاحق، استخدمت منهجية رسم الخرائط FRET لتوضيح تشكيل وموقع تسلسل الإشارة والمنطقة الناضجة المبكرة في وجود SecYEG كما هو موضح أدناه3.
سمحت لنا معرفة الهيكل ثلاثي الأبعاد لمجمع SecA-SecYEG 33,34,35 والموقع المحتمل لموقع الربط بوضع ملصقات المانحين والمتقبلين بحكمة في المواقع التي يحدد فيها تقاطع مسافات FRET الفردية موقع موقع الربط. كشفت قياسات رسم الخرائط FRET هذه أن تسلسل الإشارة والمنطقة الناضجة المبكرة من البروتين المسبق يشكلان دبوس شعر مع وجود الطرف عند فم قناة SecYEG ، مما يدل على أن بنية دبوس الشعر يتم تشكيلها قبل إدخال القناة.
Protocol
Representative Results
Discussion
من خلال استخدام منهجية رسم الخرائط FRET ، حددنا موقع ربط تسلسل الإشارة على بروتين SecA. الأهم من ذلك ، أن وجود بنية بلورية 3-D للمجمع سهل دراستنا بشكل كبير. تكمن قوة منهجية رسم الخرائط هذه في القدرة على استخدام هيكل موجود لتحديد المواقع لوضع العلامات. لا يمكن استخدام هذه المنهجية لتحديد هيكل 3-D. و…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R15GM135904 (الممنوحة ل IM) ومنحة المعاهد الوطنية للصحة GM110552 (الممنوحة ل DBO).
Materials
| 490 nm LED laser | Horiba | 1684-LED | |
| Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne | Life Technologies | A20347 | |
| Agar | Difco | DF0812 | |
| Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne | Life Technologies | A10254 | |
| Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne | Life Technologies | S10904 | |
| Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne | Life Technologies | S10906 | |
| Amicon Ultra4 Centrifugal filter (50kDa MWCO) | Sigma | UFC805008 | |
| Dodecylmaltoside (DDM) | Anatrace | D310 | |
| E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22 | Biomolecules Midwest | N/A | Synthesized custom item |
| extended signal peptide SP41 | Biomolecules Midwest | N/A | Synthesized custom item |
| FluorEssence | Horiba | version 2.4 | spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer |
| Fluoromax 4 spectrofluorometer | Horiba | N/A | |
| GlobalsWE | Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine | spectral analysis program for time-resolved decays | |
| H4AzidoPheOH | BACHEM | 4020250.0001 | |
| LB (Miller) Broth | Fisher Scientific | BP9723 | |
| Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O) | Sigma-Aldrich | 420816 | dilution is needed to make a proper scattering solution |
| PTI Felix GX | Horiba | version 4.1.0.4096 | spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument |
| PTI Time Master Instrument | Horiba | NA | |
| Pymol Molecular Graphics Program | Schrodinger | version 2.4 | |
| Water bath | Thermo Scientific | NESLAB RTE 10 |
Referanslar
- Thompson, M. C., Yeates, T. O., Rodriguez, J. A. Advances in methods for atomic resolution macromolecular structure determination. F1000Research. 9, (2020).
- Zhang, Q., Li, Y., Olson, R., Mukerji, I., Oliver, D. Conserved SecA signal peptide-binding site revealed by engineered protein chimeras and Forester resonance energy transfer. Biyokimya. 55 (9), 1291-1300 (2016).
- Zhang, Q., et al. Alignment of the protein substrate hairpin along the SecA two-helix finger primes protein transport in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9343-9348 (2017).
- Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
- Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool – understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
- Magde, D., Wong, R., Seybold, P. G. Fluorescence quantum yields and their relation to lifetimes of rhodamine 6G and fluorescein in nine solvents: improved absolute standards for quantum yields. Photochemistry and Photobiology. 75 (4), 327-334 (2002).
- Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods in Enzymology. 211, 353-388 (1992).
- . R0 Values from Some Alexa Fluor Dyes – Table 1.6 Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/tables/r0-values-for-some-alexa-fluor-dyes.html (2021)
- Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors. 16 (9), 1488 (2016).
- Day, R. N., Davidson, M. W. Fluorescent proteins for FRET microscopy: monitoring protein interactions in living cells. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular, and Developmental Biology. 34 (5), 341-350 (2012).
- Lee, S. J., Syed, S., Ha, T. Single-Molecule FRET Analysis of Replicative Helicases. Methods in Molecular Biology. 1805, 233-250 (2018).
- Uhm, H., Hohng, S. Single-Molecule FRET Assay for Studying Cotranscriptional RNA Folding. Methods in Molecular Biology. 2106, 271-282 (2020).
- Globyte, V., Joo, C. Single-molecule FRET studies of Cas9 endonuclease. Methods in Enzymology. 616, 313-335 (2019).
- Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. Single-Molecular Förster Resonance Energy Transfer Measurement on Structures and Interactions of Biomolecules. Micromachines. 12 (5), 492 (2021).
- Catipovic, M. A., Bauer, B. W., Loparo, J. J., Rapoport, T. A. Protein translocation by the SecA ATPase occurs by a power-stroke mechanism. The EMBO Journal. 38 (9), 101140 (2019).
- Seinen, A. B., Spakman, D., van Oijen, A. M., Driessen, A. J. M. Cellular dynamics of the SecA ATPase at the single molecule level. Scientific Reports. 11 (1), 1433 (2021).
- Dimura, M., et al. Quantitative FRET studies and integrative modeling unravel the structure and dynamics of biomolecular systems. Current Opinion in Structural Biology. 40, 163-185 (2016).
- Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nature Methods. 9 (12), 1218-1225 (2012).
- Paetzel, M. Structure and mechanism of Escherichia coli type I signal peptidase. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (8), 1497-1508 (2014).
- Ng, D., Brown, J., Walter, P. Signal sequences specify the targeting route to the endoplasmic reticulum membrane. The Journal of Cell Biology. 134 (2), 269-278 (1996).
- Huber, D., et al. SecA Cotranslationally Interacts with Nascent Substrate Proteins In Vivo. Journal of Bacteriology. 199 (2), 00622 (2017).
- Lill, R., et al. SecA protein hydrolyzes ATP and is an essential component of the protein translocation ATPase of Escherichia coli. The EMBO Journal. 8 (3), 961-966 (1989).
- Lill, R., Dowhan, W., Wickner, W. The ATPase activity of SecA is regulated by acidic phospholipids, SecY, and the leader and mature domains of precursor proteins. Cell. 60 (2), 271-280 (1990).
- Kimura, E., Akita, M., Matsuyama, S., Mizushima, S. Determination of a region of SecA that interacts with presecretory proteins in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6600-6606 (1991).
- Hunt, J. F., et al. Nucleotide control of interdomain interactions in the conformational reaction cycle of SecA. Science. 297 (5589), 2018-2026 (2002).
- Sharma, V., et al. Crystal structure of Mycobacterium tuberculosis SecA, a preprotein tranlsocating ATPase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2243-2248 (2003).
- Vassylyev, D., et al. Crystal structure of the translocation ATPase SecA from Thermus thermophilus reveals a parallel, head-to-head dimer. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 248-258 (2006).
- Zimmer, J., Li, W., Rapoport, T. A. A novel dimer interface and conformational changes revealed by an X-ray structure of B. subtilis SecA. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 259-265 (2006).
- Zimmer, J., Rapoport, T. A. Conformational flexibility and peptide interaction of the translocation ATPase SecA. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 606-612 (2009).
- Bauer, B. W., Rapoport, T. A. Mapping polypeptide interactions of the SecA ATPase during translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (49), 20800-20805 (2009).
- Auclair, S., et al. Mapping of the signal peptide-binding domain of Escherichia coli SecA using Förster resonance energy transfer. Biyokimya. 49 (4), 782-792 (2010).
- Zimmer, J., Nam, Y., Rapoport, T. A. Structure of a complex of the ATPase SecA and the protein-translocation channel. Nature. 455 (7215), 936-943 (2008).
- Li, L., et al. Crystal structure of a substrate-engaged SecY protein-translocation channel. Nature. 531 (7594), 395-399 (2016).
- Ma, C., et al. Structure of the substrate-engaged SecA-SecY protein translocation machine. Nature Communications. 10 (1), 2872 (2019).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
- Jilaveanu, L. B., Oliver, D. In vivo membrane topology of Escherichia coli SecA ATPase reveals extensive periplasmic exposure of multiple functionally important domains clustering on one face of SecA. The Journal of Biological Chemistry. 282 (7), 4661-4668 (2007).
- Ramamurthy, V., Oliver, D. Topology of the integral-membrane form of Escherichiacoli SecA protein. The Journal of Biological Chemistry. 272 (37), 23239-23246 (1997).
- Chin, J., et al. Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
- Deiters, A., et al. Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae. Journal of the American Chemical Society. 125 (39), 11782-11783 (2003).
- Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Analytical Biochemistry. 100 (1), 95-97 (1979).
- Mitchell, C., Oliver, D. B. Two distinct ATP-binding domains are needed to promote protein export by Escherichia coli SecA ATPase. Molecular Microbiology. 10 (3), 483-497 (1993).
- Thiol-reactive Probe Labeling Protocol. Thermo Fischer Scientific Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/thiol-reactive-probe-labeling-protocol.html (2021)
- Click Chemistry – Section 3.1. Thermo Fischer Scientific Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/reagents-for-modifying-groups-other-than-thiols-or-amines/click-chemistry.html (2021)
- Correction Factor. AAT Bioquest Available from: https://www.aatbio.com/resources/correction-factor/ (2019)
- Calculate dye:protein (F/P) molar ratios. Thermo Fischer Scientific Available from: https://tools.thermofischer.com/content/sfs/brochures/TR0031-Calc-FP-rations.pdf (2011)
- A Guide to Recording Fluorescence Quantum Yields. Horiba Scientific Available from: https://static.horiba.com/fileadmin/Horiba/Application/Materials/Material_Research/Quantum_Dots/quantumyieldstrad.pdf (2011)
- Ivanov, V., Li, M., Mizuuchi, K. Impact of emission anisotropy on fluorescence stectroscopy and FRET distance measurements. Biophysical Journal. 97 (3), 922-929 (2009).
- Auclair, S., Oliver, D., Mukerji, I. Defining the solution state dimer structure of Escherichia coli SecA using Forster resonance energy transfer. Biyokimya. 52 (14), 2388-2401 (2013).
- . The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.4 Available from: https://pymol.org/2/ (2021)
- Musial-Siwek, M., Rusch, S. L., Kendall, D. A. Selective photoaffinity labeling identifies the signal peptide binding domain on SecA. Journal of Molecular Biology. 365 (3), 637-648 (2007).
- Miller, A., Wang, L., Kendall, D. A. Synthetic signal peptides specifically recognize SecA and stimulate ATPase activity in the absence of preprotein. The Journal of Biological Chemistry. 273 (19), 11409-11412 (1998).
- Gelis, I., et al. Structural basis for signal-sequence recognition by the translocase motor SecA as determined by NMR. Cell. 131 (4), 756-769 (2007).
- Erlandson, K. J., et al. A role for the two-helix finger of the SecA ATPase in protein translocation. Nature. 455 (7215), 984-988 (2008).
- Das, S., Oliver, D. Mapping of the SecA-SecY and SecA-SecG interfaces by site-directed in vivo photocross-linking. The Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12371-12380 (2011).
- Wheatley, E. G., Pieniazek, S. N., Vitoc, I., Mukerji, I., Beveridge, D. L. Molecular Dynamics Structure Prediction of a Novel Protein-DNA Complex: Two HU Proteins with a DNA Four-way Junction. Innovations in Biomolecular Modeling and Simulations: Volume 2. , 111-128 (2012).
- Vitoc, C. I., Mukerji, I. HU binding to a DNA four-way junction probed by Förster resonance energy transfer. Biyokimya. 50 (9), 1432-1441 (2011).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
