ניקוי אופטי של רקמות צמחים להדמיית פלואורסצנטיות
Özet
כאן, מתוארת שיטה להפיכת רקמות הצמח לשקופות תוך שמירה על יציבות חלבונים פלואורסצנטיים. טכניקה זו מאפשרת הדמיה עמוקה של רקמות צמחים מנוקות ללא חתך פיזי.
Abstract
זה מאתגר להתבונן ישירות במבנה הפנימי של דגימות צמחים רב שכבתיות ואטומות, ללא ניתוח, תחת מיקרוסקופ. בנוסף, autofluorescence המיוחס כלורופיל מעכב את התצפית של חלבונים פלואורסצנטיים בצמחים. במשך זמן רב, ריאגנטים ניקוי שונים שימשו כדי להפוך את הצמחים שקופים. עם זאת, ריאגנטים ניקוי קונבנציונאלי להפחית אותות פלואורסצנטיים; לכן, לא ניתן היה לצפות במבנים התאיים והתאיים עם חלבונים פלואורסצנטיים. ריאגנטים פותחו שיכולים לנקות רקמות צמחיות על ידי הסרת כלורופיל תוך שמירה על יציבות חלבון פלואורסצנטי. פרוטוקול מפורט מסופק כאן עבור ניקוי אופטי של רקמות צמח באמצעות ריאגנטים ניקוי, ClearSee (CS) או ClearSeeAlpha (CSA). הכנת רקמות צמחיות מנוקות כרוכה בשלושה שלבים: קיבעון, כביסה ופינוי. קיבעון הוא צעד מכריע בשמירה על המבנים התאיים והיציבות התאית של חלבונים פלואורסצנטיים. זמן הדגירה לניקוי תלוי בסוג הרקמה ובמינים. ב – Arabidopsis thaliana, הזמן הנדרש לפינוי עם CS היה 4 ימים עבור עלים ושורשים, 7 ימים עבור שתילים, ו 1 חודש עבור pistils. CS גם נדרש זמן קצר יחסית של 4 ימים כדי להפוך את העלים gametophytic של Physcomitrium patens שקוף. לעומת זאת, pistils בטבק וטורניה מיוצר פיגמנט חום עקב חמצון במהלך טיפול במדעי המחשב. CSA הפחית את הפיגמנט החום על ידי מניעת חמצון ויכול להפוך את הטבק וטורניה pistils שקוף, אם כי זה לקח זמן רב יחסית (1 או 2 חודשים). CS ו- CSA היו תואמים גם עם כתמים באמצעות צבעים כימיים, כגון DAPI (4 ‘,6-diamidino-2-פנילינדולה) ו Hoechst 33342 עבור DNA ו Calcofluor לבן, SR2200, ואדום ישיר 23 עבור דופן התא. שיטה זו יכולה להיות שימושית עבור הדמיה של צמח שלם כדי לחשוף מורפולוגיה שלמה, תהליכים התפתחותיים, אינטראקציות צמח-חיידקים, וזיהומים נמטודים.
Introduction
הדמיה של מבנים תאיים ולוקליזציה של חלבונים באורגניזמים חיים חשובה להבהרת תפקידיהם ב- vivo. עם זאת, מכיוון שהגוף החי אינו שקוף, מאתגר להתבונן במבנה הפנימי של אורגניזמים חיים ללא ניתוח. במיוחד, במקרה של רקמות צמחיות, אשר מרובות שכבות עם תאים בצורות שונות, אי התאמה אינדקס הנגרמת על ידי המבנה שלהם ואת נוכחות של פיגמנטים סופגים אור הוא בעייתי. לדוגמה, לעלים צמחיים יש מבנה מורכב המאפשר להם לנצל ביעילות את האור שנכנס לגופם לפוטוסינתזה1, ואילו המבנה גורם גם לחוסר התאמה של מדד שבירה, מה שהופך אותם לקשים לצפייה. עם זאת, עלים יש פיגמנטים סופגים אור רבים, כגון כלורופיל, אשר פולטים פלואורסצנטיות אדומה חזקה פיגמנטים חומים מיוצרים על ידי חמצון2,3. פיגמנטים אלה גם מעכבים תצפיות מיקרוסקופיות פלואורסצנטיות בהר שלם בצמחים. לכן, עבור התבוננות במבנה הפנימי של צמחים, decolorization וקיבעון על ידי אלכוהול וניקוי באמצעות הידרציה כלורל שימשו במשך זמן רב כדי לחסל את אי התאמה אינדקס שבירה autofluorescence4,5. שיטות קונבנציונליות אלה אומצו במשך שנים רבות, אך יש להן את החיסרון של ביטול הפלואורסצנטיות של חלבונים פלואורסצנטיים בו זמנית 6,7. זה בעייתי מאז חלבונים פלואורסצנטיים הפכו חיוניים בהדמיה פלואורסצנטית הנוכחית.
לכן, ClearSee (CS) ו ClearSeeAlpha (CSA) פותחו כריאגנטים ניקוי אופטי עבור רקמות צמחיות. שני ריאגנטים להפחית כלורופיל autofluorescence תוך שמירה על היציבות של חלבונים פלואורסצנטיים7,8. CSA שימושי במיוחד כאשר פיגמנטים חומים מיוצרים בשל חמצון רקמות. באמצעות ריאגנטים ניקוי אלה, ניתן לבחון את המבנה התאי ואת לוקליזציה חלבון בתוך הגוף הצמחי ללא חתך פיזי.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטה זו מורכבת מקיבעון, כביסה וניקוי. קיבעון הוא צעד קריטי בפרוטוקול זה. אם חלבון פלואורסצנטי לא נצפה לאחר קיבוע PFA, זה לא יהיה נצפה לאחר הטיפול עם פתרון ניקוי. החדירה של פתרון PFA לתוך רקמות היא קריטית, אבל טיפול ואקום גבוה אינו מומלץ כי זה יכול להרוס את מבנה התא. תנאי ואקום ותקופות קיבעון צריך להיות ממוטב עבור כל סוג של רקמות ומינים. מומלץ לבדוק חלבונים פלואורסצנטיים גם לאחר קיבוע. למרות דגימות היו קבועים בדרך כלל במשך 30-60 דקות בטמפרטורת החדר, הם יכולים להיות קבועים ב 4 °C (4 ° C ( 4 ° C ( (לילה או יותר).
כפי שניתן לראות באיור 6A, לחלק מהנתרן דאוקסיכולטים היה צבע צהוב-חיוור בעת ההמסה. פתרונות כאלה של נתרן דאוקסיכולט הראו זרימה אוטומטית חזקה באזור 400-600 ננומטר לאחר עירור ב-380 ננומטר (איור 6B). זרם אוטומטי זה מונע ניקוי אופטי והדמיה פלואורסצנטית. משתמשים צריכים לבדוק את הצבע של פתרון נתרן deoxycholate כמו איכות הריאגנט עשוי להיות שונה בשל טוהר, וריאציה הרבה למגרש, או סיבות אחרות.
פתרונות הסליקה המשמשים כאן יש ריכוזים גבוהים של נתרן deoxycholate, אשר יכול להרוס את מבנה הממברנה. סמן קרום הפלזמה (RPS5Apro::tdTomato-LTI6b) נצפתה גם לאחר טיפול CS7. עם זאת, ייתכן שעדיף להפחית את הריכוז של נתרן deoxycholate, בהתאם למבנה ורקמת העניין. ואכן, תמונות עם בהירות משופרת הושגו עבור pistils Arabidopsis עם CS שונה, שבו הריכוז של נתרן deoxycholate מופחת בחצי; עם זאת, ריכוזים מופחתים של נתרן deoxycholate נדרש זמני טיפול ממושכים (למשל, 1 חודש עבור pistils Arabidopsis ).
CS יכול להפחית את autofluorescence אדום (>610 ננומטר) כדי להסיר כלורופיל בדגימות שטופלו. עם זאת, 500-600 ננומטר טווח autofluorescence (צהוב לכתום) נשאר אפילו בדגימות שטופלו CS7. זה autofluorescence הוא חשב נגזר דופן התא ורכיבים תאיים אחרים, כגון lignin12,13. לכן, קשה לעשות רקמות, כגון גבעולים עם קירות משניים מפותחים, שקוף לחלוטין על ידי טיפול במדעי המחשב.
מספר ריאגנטים ניקוי מלבד אלה המשמשים כאן פותחו כדי לצפות חלבונים פלואורסצנטיים בצמחים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית14,15,16,17. בהשוואה לשיטות אלה, CS ו- CSA להסיר כלורופיל ולהפחית autofluorescence, מה שהופך את רקמות הצמח שקופות יותר. לאחרונה, Sakamoto ואח ‘ פיתח שיטה משופרת, iTOMEI, לקיבעון, ניקוי דטרגנטים, הרכבה כדי להתאים את אי התאמה אינדקס שבירה18. בשתילים Arabidopsis, iTOMEI ניקה את הרקמה בתוך 26 שעות.
CS חל על מגוון רחב של מיני צמחים, כגון Arabidopsis thaliana, Physcomitrium patens7, Chrysanthemum morifolium, Cucumis sativus, Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Torenia fournieri8, Allium ochotense19, Astragalus sinicus20, אבוקדו21, שעורה22, Brassica rapa23, Callitriche 24, אקליפטוס25, תירס26, מרצ’נטיה פולימורפ27, מונופילאאה גלאברה28, אורובנצ’ה מינור29, פטוניה30, אורז31, סולנום ליקופרסיקום32, פולי סויה33, תות שדה34, חיטה35, וולפיאלה היאלינה36. עבור רקמות עבות יותר, CS יכול גם להפוך את מקטעי הרטט לשקופים 37,38. שיטה זו אפשרה מחקרים של המבנה התאי ודפוסי ביטוי הגנים בצמחים37,38. יתר על כן, זיהומים נמטודות20,39, זיהומים פטרייתיים, וסימביוזה19,40,41 נצפו גם עמוק בתוך הרקמות שטופלו ב- CS. לפיכך, שיטה זו שימושית להדמיית רקמות שלמות ממיקרו-קשקשים ועד קשקשי מאקרו ויכולה לעזור לגלות אינטראקציות חדשניות בין תאים, רקמות, איברים ואורגניזמים שונים.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי האגודה היפנית לקידום המדע (מענק בסיוע למחקר מדעי על תחומים חדשניים (JP16H06464, JP16H06280 ל- T.H.), מענק סיוע למחקר מדעי (B, JP17H03697 ל- D.K.), מענק בסיוע למחקר אקספלורציה מאתגר (JP18K19331 ל- D.K.), מענק בסיוע למחקר מדעי על תחומים חדשניים (JP20H0H053358 עבור D.K.)) וסוכנות המדע והטכנולוגיה היפנית (תוכנית PRESTO (JPMJPR15QC עד Y.M., JPMJPR18K4 לD.K.)). המחברים מודים למרכז ההדמיה החיה במכון לביו-מולקולות טרנספורמטיביות (WPI-ITbM) של אוניברסיטת נגויה על תמיכתם במחקרים המיקרוסקופיים ובעריכה (www.editage.com) לעריכת השפה האנגלית.
Materials
| Calcofluor White | Sigma-Aldrich | F3543 | Fluorescent Brightener 28; 100 mg/mL in H2O |
| ClearSee | 10% (w/v) xylitol, 15% (w/v) sodium deoxycholate, 25% (w/v) urea | ||
| Cover glass (18×18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
| Cover glass (24×24 No.1) | MATSUNAMI | C024241 | |
| Cover glass (25×60 No.1) | MATSUNAMI | C025601 | |
| Desiccator | AS One | 1-5801-11 | |
| Hoechst 33342 | DOJINDO | 346-07951 | 1 mg/mL in H2O |
| Needle | TERUMO | NN-2238S | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
| Phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
| Silicone rubber sheet | AS One | 6-9085-12 | |
| Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | Figure 6_1; Lot PSGYK-QB |
| Sodium deoxycholate | Kishida Chemical | 260-71412 | Figure 6_2; Lot C05543H |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Figure 6_3; Lot SLBS7362 |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | Figure 6_4; Lot BCBW0612 |
| Sodium deoxycholate | Nacalai Tesque | 10712-96 | Figure 6_5; Lot M5R3403 |
| Sodium deoxycholate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 194-08311 | Figure 6_6; Lot LKL0648 |
| Sodium hydroxide | Nacalai Tesque | 31511-05 | |
| Sodium sulphite | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-03411 | |
| Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
| Vacuum pump | BUCHI | V-700 | |
| Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |
Referanslar
- Vogelmann, T. C. Light within the plant. Photomorphogenesis in Plants. , 491-535 (1994).
- Krause, G. H., Weis, E. Chlorophyll fluorescence and photosynthesis: The basics. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 42 (1), 313-349 (1991).
- Pourcel, L., Routaboul, J., Cheynier, V., Lepiniec, L., Debeaujon, I. Flavonoid oxidation in plants: from biochemical properties to physiological functions. Trends in Plant Science. 12 (1), 29-36 (2007).
- Lersten, N. R. An annotated bibliography of botanical clearing methods. Iowa State Journal of Science. 41 (4), 481-486 (1967).
- Villani, T. S., Koroch, A. R., Simon, J. E. An improved clearing and mounting solution to replace chloral hydrate in microscopic applications. Applications in Plant Sciences. 1 (5), 1300016 (2013).
- Becker, K., Jährling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. -. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS ONE. 7 (3), 33916 (2012).
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: a rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Nagahara, S., Higashiyama, T. ClearSeeAlpha: advanced optical clearing for whole-plant imaging. Plant and Cell Physiology. 62 (8), 1302-1310 (2021).
- Ursache, R., Andersen, T. G., Marhavý, P., Geldner, N. A protocol for combining fluorescent proteins with histological stains for diverse cell wall components. The Plant Journal. 93 (2), 399-412 (2018).
- Tofanelli, R., Vijayan, A., Scholz, S., Schneitz, K. Protocol for rapid clearing and staining of fixed Arabidopsis ovules for improved imaging by confocal laser scanning microscopy. Plant Methods. 15 (1), 120 (2019).
- Vijayan, A., et al. A digital 3D reference atlas reveals cellular growth patterns shaping the Arabidopsis ovule. eLife. 10, 1-38 (2021).
- Müller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., George Barisas, B., Seidel, T. Quantification of Förster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Science. 4, 1-20 (2013).
- Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues. Protoplasma. 252, 1231-1240 (2015).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll. New Phytologist. 186 (4), 1018-1025 (2010).
- Warner, C. A., et al. An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with fluorescence microscopy. Plant Physiology. 166 (4), 1684-1687 (2014).
- Hasegawa, J., et al. Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique. Plant and Cell Physiology. 57 (3), 462-472 (2016).
- Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. A versatile optical clearing protocol for deep tissue imaging of fluorescent proteins in Arabidopsis thaliana. PLOS ONE. 11 (8), 0161107 (2016).
- Sakamoto, Y., et al. Improved clearing method contributes to deep imaging of plant organs. Research Square. , (2021).
- Tanaka, E., Ono, Y. Whole-leaf fluorescence imaging to visualize in planta fungal structures of Victory onion leaf rust fungus, Uromyces japonicus, and its taxonomic evaluation. Mycoscience. 59 (2), 137-146 (2018).
- Ohtsu, M., et al. Spatiotemporal deep imaging of syncytium induced by the soybean cyst nematode Heterodera glycines. Protoplasma. 254, 2107-2115 (2017).
- Duman, Z., et al. Short de-etiolation increases the rooting of VC801 Avocado rootstock. Plants. 9 (11), 1481 (2020).
- Ho, W. W. H., et al. Integrative multi-omics analyses of barley rootzones under salinity stress reveal two distinctive salt tolerance mechanisms. Plant Communications. 1 (3), 100031 (2020).
- Arsovski, A. A., et al. BrphyB is critical for rapid recovery to darkness in mature Brassica rapa leaves. bioRxiv. , (2020).
- Doll, Y., Koga, H., Tsukaya, H. The diversity of stomatal development regulation in Callitriche is related to the intrageneric diversity in lifestyles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (14), (2021).
- Eliyahu, A., et al. Vegetative propagation of elite Eucalyptus clones as food source for honeybees (Apis mellifera); adventitious roots versus callus formation. Israel Journal of Plant Sciences. 67 (1-2), 83-97 (2020).
- Kelliher, T., et al. MATRILINEAL, a sperm-specific phospholipase, triggers maize haploid induction. Nature. 542, 105-109 (2017).
- Aki, S. S., et al. Cytokinin signaling is essential for organ formation in Marchantia polymorpha. Plant and Cell Physiology. 60 (8), 1842-1854 (2019).
- Kinoshita, A., Koga, H., Tsukaya, H. Expression profiles of ANGUSTIFOLIA3 and SHOOT MERISTEMLESS, key genes for meristematic activity in a one-leaf plant Monophyllaea glabra, revealed by whole-mount in situ hybridization. Frontiers in Plant Science. 11, 1-11 (2020).
- Okazawa, A., et al. Localization of planteose hydrolysis during seed germination of Orobanche minor. bioRxiv. , 448768 (2021).
- Chen, M., et al. VAPYRIN attenuates defence by repressing PR gene induction and localized lignin accumulation during arbuscular mycorrhizal symbiosis of Petunia hybrida. New Phytologist. 229 (6), 3481-3496 (2021).
- Chu, T. T. H., et al. Sub-cellular markers highlight intracellular dynamics of membrane proteins in response to abiotic treatments in rice. Rice. 11, 23 (2018).
- Alaguero-Cordovilla, A., et al. An auxin-mediated regulatory framework for wound-induced adventitious root formation in tomato shoot explants. Plant, Cell & Environment. 44 (5), 1642-1662 (2021).
- Okuda, A., Matsusaki, M., Masuda, T., Urade, R. Identification and characterization of GmPDIL7, a soybean ER membrane-bound protein disulfide isomerase family protein. The FEBS Journal. 284 (3), 414-428 (2017).
- Kim, D. -. R., et al. A mutualistic interaction between Streptomyces bacteria, strawberry plants and pollinating bees. Nature Communications. 10 (1), 4802 (2019).
- Wu, J., Mock, H. -. P., Giehl, R. F. H., Pitann, B., Mühling, K. H. Silicon decreases cadmium concentrations by modulating root endodermal suberin development in wheat plants. Journal of Hazardous Materials. 364, 581-590 (2019).
- Isoda, M., Oyama, T. Use of a duckweed species, Wolffiella hyalina, for whole-plant observation of physiological behavior at the single-cell level. Plant Biotechnology. 35 (4), 387-391 (2018).
- Ben-Targem, M., Ripper, D., Bayer, M., Ragni, L. Auxin and gibberellin signaling cross-talk promotes hypocotyl xylem expansion and cambium homeostasis. Journal of Experimental Botany. 72 (10), 3647-3660 (2021).
- Shwartz, I., et al. The VIL gene CRAWLING ELEPHANT controls maturation and differentiation in tomato via polycomb silencing. bioRxiv. , (2021).
- Levin, K. A., Tucker, M. R., Strock, C. F., Lynch, J. P., Mather, D. E. Three-dimensional imaging reveals that positions of cyst nematode feeding sites relative to xylem vessels differ between susceptible and resistant wheat. Plant Cell Reports. 40 (2), 393-403 (2021).
- Nouri, E., et al. Phosphate suppression of arbuscular mycorrhizal symbiosis involves gibberellic acid signaling. Plant and Cell Physiology. 62 (6), 959-970 (2021).
- Evangelisti, E., et al. Artificial intelligence enables the identification and quantification of arbuscular mycorrhizal fungi in plant roots. bioRxiv. , 434067 (2021).
