Aqui, é descrito um método para tornar os tecidos vegetais transparentes, mantendo a estabilidade das proteínas fluorescentes. Esta técnica facilita a imagem profunda de tecidos vegetais limpos sem seção física.
É desafiador observar diretamente a estrutura interna de espécimes vegetais multicamadas e opacos, sem dissecção, sob um microscópio. Além disso, a autofluorescência atribuída à clorofila dificulta a observação de proteínas fluorescentes nas plantas. Por muito tempo, vários reagentes de compensação têm sido usados para tornar as plantas transparentes. No entanto, os reagentes de compensação convencionais diminuem sinais fluorescentes; portanto, não foi possível observar as estruturas celulares e intracelulares com proteínas fluorescentes. Foram desenvolvidos reagentes que podem limpar tecidos vegetais removendo clorofila, mantendo a estabilidade da proteína fluorescente. Um protocolo detalhado é fornecido aqui para a limpeza óptica de tecidos vegetais usando reagentes de compensação, ClearSee (CS) ou ClearSeeAlpha (CSA). A preparação de tecidos vegetais limpos envolve três etapas: fixação, lavagem e limpeza. A fixação é um passo crucial na manutenção das estruturas celulares e estabilidade intracelular de proteínas fluorescentes. O tempo de incubação para limpeza depende do tipo de tecido e espécie. Em Arabidopsis thaliana, o tempo necessário para compensação com CS foi de 4 dias para folhas e raízes, 7 dias para mudas e 1 mês para pistils. CS também exigiu um tempo relativamente curto de 4 dias para tornar transparente as folhas gametofíticas de Physcomitrium patens . Em contraste, pistils no tabaco e torenia produziram pigmento marrom devido à oxidação durante o tratamento de SC. CSA reduziu o pigmento marrom prevenindo a oxidação e poderia tornar o tabaco e torenia pistils transparentes, embora tenha demorado um tempo relativamente longo (1 ou 2 meses). CS e CSA também foram compatíveis com a coloração utilizando corantes químicos, como DAPI (4′,6-diamidino-2-fenildole) e Hoechst 33342 para DNA e Calcofluor White, SR2200 e Direct Red 23 para a parede celular. Este método pode ser útil para imagens de plantas inteiras para revelar morfologia intacta, processos de desenvolvimento, interações vegetais-micróbios e infecções por nematoides.
A visualização de estruturas celulares e a localização de proteínas em organismos vivos é importante para o esclarecimento de suas funções in vivo. No entanto, como o corpo vivo não é transparente, é desafiador observar a estrutura interna dos organismos vivos sem dissecção. Especialmente, no caso dos tecidos vegetais, que são multicamadas com células de diferentes formas, a incompatibilidade de índice causada por sua estrutura e a presença de pigmentos absorventes de luz é problemática. Por exemplo, as folhas de plantas têm uma estrutura complexa que lhes permite utilizar eficientemente a luz que entra em seus corpos para fotossíntese1, enquanto a estrutura também causa incompatibilidade de índice refrativo, dificultando a observação. No entanto, as folhas têm muitos pigmentos absorventes de luz, como a clorofila, que emitem forte fluorescência vermelha e pigmentos acastanhados são produzidos por oxidação2,3. Esses pigmentos também dificultam observações de microscopia de fluorescência de montagem total nas plantas. Portanto, para observar a estrutura interna das plantas, a descoloração e a fixação por álcool e a desobstrução por meio de hidrato cloral têm sido utilizadas há muito tempo para eliminar o incompatibilidade do índice refrativo e a autofluorescência4,5. Esses métodos convencionais têm sido adotados por muitos anos, mas têm a desvantagem de eliminar a fluorescência das proteínas fluorescentes ao mesmo tempo6,7. Isso é problemático, uma vez que as proteínas fluorescentes tornaram-se indispensáveis na imagem fluorescente atual.
Portanto, clearSee (CS) e ClearSeeAlpha (CSA) foram desenvolvidos como reagentes de compensação óptica para tecidos vegetais. Ambos os reagentes reduzem a autofluorescência da clorofila, mantendo a estabilidade das proteínas fluorescentes7,8. CSA é particularmente útil quando pigmentos marrons são produzidos devido à oxidação tecidual. Utilizando esses reagentes de compensação, é possível observar a estrutura celular e a localização da proteína dentro do corpo da planta sem secção física.
Este método consiste em fixação, lavagem e limpeza. A fixação é um passo crítico neste protocolo. Se a proteína fluorescente não for observada após a fixação da PFA, ela não será observada após o tratamento com solução de compensação. A penetração da solução PFA em tecidos é crítica, mas o tratamento de alto vácuo não é recomendado porque pode destruir a estrutura celular. As condições de vácuo e os períodos de fixação devem ser otimizados para cada tipo de tecido e espécie. Recomenda-se verificar proteínas fluorescentes mesmo após a fixação. Embora as amostras tenham sido geralmente fixadas por 30-60 min em temperatura ambiente, elas podem ser fixadas a 4 °C por mais tempo (durante a noite ou mais).
Como mostrado na Figura 6A, alguns desoxicorados de sódio tinham uma cor amarelo-pálida quando dissolvidos. Tais soluções de desoxicolato de sódio apresentaram forte autofluorescência na região de 400-600 nm após excitação a 380 nm (Figura 6B). Esta autofluorescência previne a limpeza óptica e a imagem de fluorescência. Os usuários devem verificar a cor da solução de desoxicolato de sódio, pois a qualidade do reagente pode diferir devido à pureza, variação de lot-to-lot, ou outras razões.
As soluções de compensação utilizadas aqui têm altas concentrações de desoxicolato de sódio, o que poderia destruir a estrutura da membrana. O marcador de membrana plasmática (RPS5Apro::tdTomato-LTI6b) foi observado mesmo após o tratamento de CS7. No entanto, pode ser melhor reduzir a concentração de desoxicolato de sódio, dependendo da estrutura e tecido de interesse. De fato, foram obtidas imagens com maior clareza para arabidopsis pistils com CS modificado, em que a concentração de desoxicolato de sódio é reduzida pela metade; no entanto, as concentrações reduzidas de desoxicolato de sódio exigiram tempos prolongados de tratamento (por exemplo, 1 mês para arabidopsis pistils).
CS pode reduzir a autofluorescência vermelha (>610 nm) para remover clorofila em amostras tratadas. No entanto, a autofluorescência de alcance de 500-600 nm (amarelo a laranja) permaneceu mesmo em amostras tratadas com CS7. Acredita-se que essa autofluorescência seja derivada da parede celular e de outros componentes celulares, como o lignina12,13. Portanto, é difícil fazer tecidos, como caules com paredes secundárias desenvolvidas, completamente transparentes pelo tratamento de CS.
Vários reagentes de compensação além dos utilizados aqui foram desenvolvidos para observar proteínas fluorescentes em plantas utilizando microscopia fluorescente14,15,16,17. Em comparação com esses métodos, CS e CSA removem a clorofila e reduzem a autofluorescência, tornando os tecidos vegetais mais transparentes. Recentemente, Sakamoto et al. desenvolveram um método aprimorado, iTOMEI, para fixação, compensação de detergentes e montagem para ajustar o índice refrativo incompatível18. Nas mudas arabidopsis, o iTOMEI limpou o tecido dentro de 26 h.
CS é aplicável a uma ampla gama de espécies vegetais, como Arabidopsis thaliana, Physcomitrium patens7, Chrysanthemum morifolium, Cucumis sativus, Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Torenia fournieri8, Allium ochotense19, Astragalus sinicus20, abacate21, cevada22, Brassica rapa23, Callitriche 24, Eucalipto25, milho26, Marchantia polymorpha27, Monophyllaea glabra28, Orobanche minor29, petúnia30, rice31, Solanum lycopersicum32, soja33, morango34, trigo35 e Wolffiella hyalina36. Para tecidos mais grossos, a CS também pode tornar transparentes as seções vibratome37,38. Esse método permitiu estudos da estrutura celular e padrões de expressão genética em plantas37,38. Além disso, também foram observadas infecções por nematoide20,39, infecções fúngicas e simbiose19,40,41 no interior dos tecidos tratados com ESC. Assim, este método é útil para imagens de tecido inteiros de micro a macroescamas e poderia ajudar a descobrir novas interações entre várias células, tecidos, órgãos e organismos.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pela Japan Society for the Promotion of Science (Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (JP16H06464, JP16H06280 to T.H.), Grant-in-Aid for Scientific Research (B, JP17H03697 a D.K.), Grant-in-Aid for Challenge Exploratory Research (JP18K19331 to D.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (JP20H05358 for D.K.)) e a Japan Science and Technology Agency (programa PRESTO (programa PRESTO (JPMJPR15QC to Y.M., JPMJPR18K4 a D.K.)). Os autores agradecem ao Centro de Imagem Ao Vivo do Instituto de Bio-Moléculas Transformadoras (WPI-ITbM) da Universidade de Nagoya por apoiar os estudos microscópicos e a edição (www.editage.com) para edição em língua inglesa.
Calcofluor White | Sigma-Aldrich | F3543 | Fluorescent Brightener 28; 100 mg/mL in H2O |
ClearSee | 10% (w/v) xylitol, 15% (w/v) sodium deoxycholate, 25% (w/v) urea | ||
Cover glass (18×18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
Cover glass (24×24 No.1) | MATSUNAMI | C024241 | |
Cover glass (25×60 No.1) | MATSUNAMI | C025601 | |
Desiccator | AS One | 1-5801-11 | |
Hoechst 33342 | DOJINDO | 346-07951 | 1 mg/mL in H2O |
Needle | TERUMO | NN-2238S | |
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
Paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
Phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
Silicone rubber sheet | AS One | 6-9085-12 | |
Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | Figure 6_1; Lot PSGYK-QB |
Sodium deoxycholate | Kishida Chemical | 260-71412 | Figure 6_2; Lot C05543H |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Figure 6_3; Lot SLBS7362 |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | Figure 6_4; Lot BCBW0612 |
Sodium deoxycholate | Nacalai Tesque | 10712-96 | Figure 6_5; Lot M5R3403 |
Sodium deoxycholate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 194-08311 | Figure 6_6; Lot LKL0648 |
Sodium hydroxide | Nacalai Tesque | 31511-05 | |
Sodium sulphite | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-03411 | |
Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
Vacuum pump | BUCHI | V-700 | |
Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |