Quantificazione della motilità dello sciame di superficie batterica su piastre gradienti induttori

La motilità dello sciame batterico si riferisce alla migrazione collettiva delle cellule batteriche attraverso la superficie di una sostanza. Oltre alle piastre di agar semisolide appositamente preparate in ^laboratorio1, questo fenotipo si osserva anche su alcuni substrati molli come tessuti ^animali2, superfici idratate3 e radici ^vegetali4. Mentre una superficie semisolida è considerata una delle condizioni fondamentali per lo sciame batterico, alcune specie richiedono anche un mezzo ricco di energia per supportare la loro motilità dello ^sciame5. La rotazione dei flagelli alimenta sia il nuoto che lo sciame motilità: il nuoto descrive la motilità unicellulare all’interno di un ambiente liquido, mentre lo sciame è il movimento sincrono di una popolazione microbica su superfici semisolide.

La viscosità del substrato influenza la motilità batterica; studi su microbi patogeni, come l’Helicobacter pylori, hanno dimostrato che la motilità del patogeno cambia a seconda della viscosità dello strato di mucina, che è influenzata dall’acidificazione ambientale nell’ospite ^umano6. Per replicare questi ambienti, studi precedenti che utilizzavano una concentrazione di agar superiore allo 0,3% (p / v) limitano la motilità del nuoto batterico per effettuare un graduale spostamento nello sciame superficiale. L’uso di concentrazioni di agar superiori all’1% (p/v) previene la motilità brulicante di molte ^specie7. I modelli di colonie formati sulla superficie sono diversi, tra cui ^mat8 senza caratteristiche, occhio di ^bue9, dendrites10 e ^vortex11.

Sebbene la rilevanza di tali modelli rimanga poco chiara, tali modelli sembrano dipendere da segnali ambientali e ^chimici12. I segnali ambientali coprono diversi aspetti, tra cui temperatura, salinità, luce e pH, mentre i segnali chimici includono la presenza di molecole microbiche di quorum sensing, sottoprodotti biochimici e sostanze nutritive. Molecole di segnalazione con quorum sensing autoinduttore come AHL (N-esanolo-L omoserina lattone) possono avere un impatto sullo sciame superficiale regolando la produzione di tensioattivo13,14. Il resveratrolo, un composto fitoalessico, potrebbe limitare la motilità dello sciame ^batterico15.

Nel presente lavoro, studiamo l’effetto delle concentrazioni di gradiente di resveratrolo sul ceppo Escherichia coli K12 di tipo selvatico e studiamo la motilità dello sciame inducibile dall’arabinosio delle specie ingegnerizzate E. coli K12-YdeH e Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH. La produzione dell’enzima YdeH è indotta dall’arabinosio attraverso il promotore araBAD, con conseguente perturbazione cellulare c-di-GMP e influenza la motilità dello sciame ^{batterico16,17}. Questo comportamento di sciame inducibile è studiato utilizzando piastre di sciame a gradiente di arabinosio con ceppi di E. coli K12-YdeH e P. aeruginosa PAO1-YdeH.

Le piastre dello sciame gradiente vengono preparate solidificando successivamente il mezzo a doppio strato (Figura 1B). Lo strato inferiore comprende il mezzo aggiunto con l’induttore, versato su un lato di una capsula di Petri appoggiata. Dopo la solidificazione dello strato inferiore, la capsula di Petri viene restituita a una superficie piana, dove lo strato superiore contenente il mezzo senza l’induttore viene aggiunto dall’altro lato della piastra. Dopo che le piastre dello sciame sono state completamente solidificate, i pozzetti di tenuta disposti isometricamente vengono prodotti perforando i fori sulle piastre dello sciame seguendo un layout fisso (Figura 1C) o imprimendo i pozzetti utilizzando un modello stampato in 3D del coperchio della piastra contenente pioli durante il processo di polimerizzazione media (Figura supplementare S1). Un sistema di imaging su gel viene utilizzato per catturare le morfologie dello sciame in diversi punti temporali (Figura 2). L’analisi dello sciame superficiale utilizzando il software ImageJ (Figura supplementare S2) fornisce risultati quantitativi del processo di sciame superficiale (Figura 3).

Pertanto, proponiamo un metodo semplice per testare la motilità dello sciame superficiale all’interno di un intervallo di concentrazione di induttori. Questo metodo può essere utilizzato per testare risposte di concentrazione multiple di altri induttori mescolando l’induttore nel mezzo dello strato inferiore e può essere applicato ad altre specie mobili (ad esempio, Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Questo approccio potrebbe fornire risultati qualitativi e quantitativi affidabili per lo screening di un singolo induttore chimico e possono essere utilizzate piastre separate per valutare più induttori chimici.