Özet

Quantificazione della motilità dello sciame di superficie batterica su piastre gradienti induttori

Published: January 05, 2022
doi:

Özet

Qui, descriviamo l’uso di piastre a gradiente induttore per valutare la motilità dello sciame batterico ottenendo contemporaneamente risposte di concentrazione multiple.

Abstract

La motilità dello sciame batterico è un fenotipo microbiologico comune che le comunità batteriche usano per migrare su superfici semisolide. Nelle indagini sulla motilità dello sciame indotto, la concentrazione specifica di un induttore potrebbe non essere in grado di segnalare eventi che si verificano entro l’intervallo di concentrazione ottimale per suscitare le risposte desiderate da una specie. Le piastre semisolide contenenti concentrazioni multiple sono comunemente usate per studiare la risposta all’interno di un intervallo di concentrazione dell’induttore. Tuttavia, le piastre semisolide separate aumentano le variazioni della viscosità media e del contenuto di umidità all’interno di ciascuna piastra a causa del tempo di solidificazione non uniforme.

Questo documento descrive un metodo in un’unica fase per testare contemporaneamente la motilità dello sciame superficiale su una singola piastra a gradiente, in cui i pozzetti di prova disposti isometricamente consentono l’acquisizione simultanea di risposte multiconcentranti. Nel presente lavoro, lo sciame superficiale di Escherichia coli K12 e Pseudomonas aeruginosa PAO1 è stato valutato in risposta a un gradiente di concentrazione di induttori come il resveratrolo e l’arabinosio. Periodicamente, le morfologie dello sciame sono state fotografate utilizzando un sistema di imaging per catturare l’intero processo di sciame superficiale.

La misurazione quantitativa delle morfologie dello sciame è stata acquisita utilizzando il software ImageJ, fornendo informazioni analizzabili dell’area dello sciame. Questo documento presenta un semplice metodo di piastra a sciame a gradiente che fornisce informazioni qualitative e quantitative sugli effetti degli induttori sullo sciame superficiale, che può essere esteso per studiare gli effetti di altri induttori su una gamma più ampia di specie batteriche mobili.

Introduction

La motilità dello sciame batterico si riferisce alla migrazione collettiva delle cellule batteriche attraverso la superficie di una sostanza. Oltre alle piastre di agar semisolide appositamente preparate in laboratorio1, questo fenotipo si osserva anche su alcuni substrati molli come tessuti animali2, superfici idratate3 e radici vegetali4. Mentre una superficie semisolida è considerata una delle condizioni fondamentali per lo sciame batterico, alcune specie richiedono anche un mezzo ricco di energia per supportare la loro motilità dello sciame5. La rotazione dei flagelli alimenta sia il nuoto che lo sciame motilità: il nuoto descrive la motilità unicellulare all’interno di un ambiente liquido, mentre lo sciame è il movimento sincrono di una popolazione microbica su superfici semisolide.

La viscosità del substrato influenza la motilità batterica; studi su microbi patogeni, come l’Helicobacter pylori, hanno dimostrato che la motilità del patogeno cambia a seconda della viscosità dello strato di mucina, che è influenzata dall’acidificazione ambientale nell’ospite umano6. Per replicare questi ambienti, studi precedenti che utilizzavano una concentrazione di agar superiore allo 0,3% (p / v) limitano la motilità del nuoto batterico per effettuare un graduale spostamento nello sciame superficiale. L’uso di concentrazioni di agar superiori all’1% (p/v) previene la motilità brulicante di molte specie7. I modelli di colonie formati sulla superficie sono diversi, tra cui mat8 senza caratteristiche, occhio di bue9, dendrites10 e vortex11.

Sebbene la rilevanza di tali modelli rimanga poco chiara, tali modelli sembrano dipendere da segnali ambientali e chimici12. I segnali ambientali coprono diversi aspetti, tra cui temperatura, salinità, luce e pH, mentre i segnali chimici includono la presenza di molecole microbiche di quorum sensing, sottoprodotti biochimici e sostanze nutritive. Molecole di segnalazione con quorum sensing autoinduttore come AHL (N-esanolo-L omoserina lattone) possono avere un impatto sullo sciame superficiale regolando la produzione di tensioattivo13,14. Il resveratrolo, un composto fitoalessico, potrebbe limitare la motilità dello sciame batterico15.

Nel presente lavoro, studiamo l’effetto delle concentrazioni di gradiente di resveratrolo sul ceppo Escherichia coli K12 di tipo selvatico e studiamo la motilità dello sciame inducibile dall’arabinosio delle specie ingegnerizzate E. coli K12-YdeH e Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH. La produzione dell’enzima YdeH è indotta dall’arabinosio attraverso il promotore araBAD, con conseguente perturbazione cellulare c-di-GMP e influenza la motilità dello sciame batterico16,17. Questo comportamento di sciame inducibile è studiato utilizzando piastre di sciame a gradiente di arabinosio con ceppi di E. coli K12-YdeH e P. aeruginosa PAO1-YdeH.

Le piastre dello sciame gradiente vengono preparate solidificando successivamente il mezzo a doppio strato (Figura 1B). Lo strato inferiore comprende il mezzo aggiunto con l’induttore, versato su un lato di una capsula di Petri appoggiata. Dopo la solidificazione dello strato inferiore, la capsula di Petri viene restituita a una superficie piana, dove lo strato superiore contenente il mezzo senza l’induttore viene aggiunto dall’altro lato della piastra. Dopo che le piastre dello sciame sono state completamente solidificate, i pozzetti di tenuta disposti isometricamente vengono prodotti perforando i fori sulle piastre dello sciame seguendo un layout fisso (Figura 1C) o imprimendo i pozzetti utilizzando un modello stampato in 3D del coperchio della piastra contenente pioli durante il processo di polimerizzazione media (Figura supplementare S1). Un sistema di imaging su gel viene utilizzato per catturare le morfologie dello sciame in diversi punti temporali (Figura 2). L’analisi dello sciame superficiale utilizzando il software ImageJ (Figura supplementare S2) fornisce risultati quantitativi del processo di sciame superficiale (Figura 3).

Pertanto, proponiamo un metodo semplice per testare la motilità dello sciame superficiale all’interno di un intervallo di concentrazione di induttori. Questo metodo può essere utilizzato per testare risposte di concentrazione multiple di altri induttori mescolando l’induttore nel mezzo dello strato inferiore e può essere applicato ad altre specie mobili (ad esempio, Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Questo approccio potrebbe fornire risultati qualitativi e quantitativi affidabili per lo screening di un singolo induttore chimico e possono essere utilizzate piastre separate per valutare più induttori chimici.

Protocol

1. Preparazione delle piastre dello sciame gradiente Preparazione dello sciame medioNOTA: Vedere la sezione di discussione per un breve confronto tra diverse viscosità medie; In questo protocollo è stata utilizzata una concentrazione di agar dello 0,7% (p/v) di mezzo sciame. Preparare il brodo di lisogenia (LB) in polvere con agar in due palloni conici; ogni pallone contiene 2 g di triptone, 2 g di cloruro di sodio, 1 g di estratto di lievito e 1,4 g di agar. Aggiungere acqua a do…

Representative Results

Il flusso di lavoro costituito dalla preparazione di piastre di sciame gradienti, inoculazione e incubazione è mostrato nella Figura 1B. Per generare piastre nuotate sfumate, il mezzo dello strato inferiore viene versato in piatti appoggiati a ~ 4,3 ° dal piano orizzontale (Figura supplementare S3), seguito dal versamento del mezzo dello strato superiore dopo che lo strato inferiore è stato completamente solidificato. La composizione del mezzo a doppio strato è mostrata …

Discussion

Lo studio della motilità dello sciame batterico su piastre a gradiente semisolido può essere un compito impegnativo18,19,20, in quanto coinvolge molteplici fattori come la viscosità del substrato, l’umidità e i componenti medi. Tra questi fattori, la concentrazione di agar svolge un ruolo decisivo nel determinare la reversione microbica alla motilità del nuoto o dello sciame. Man mano che la concentrazione di agar aumenta d…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Lo sviluppo di questa tecnica è stato supportato dai fondi del piano di ricerca e sviluppo nazionale chiave del Ministero della Scienza e della Tecnologia (2018YF0902604), della National Natural Science Foundation del Fondo di ricerca cinese per giovani scienziati internazionali (22050410270) e dei fondi esterni degli Shenzhen Institutes of Advanced Technology (DWKF20190001). Vorremmo offrire la nostra sincera gratitudine alla signorina Chen Xinyi per la sua assistenza nella revisione del documento e nella gestione del laboratorio.

Materials

Agar Sigma-Aldrich V900500 500 g
Ampicillin Solarbio A8180 25 g, ≥ 85% (GC)
Centrifuge tube Corning 430790 15 mL
Cryogenic vial Corning 430488 2 mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Aladdin D103272 AR, > 99% (GC)
L(+)-Arabinose Aladdin A106195 98% (GC), 500 g
Petri dishes Bkman B-SLPYM90-15 Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm
Resveratrol Aladdin R107315 99% (GC), 25 g
Sodium chloride Macklin S805275 AR, 99.5% (GC), 500 g
Square Petri dishes Bkman B-SLPYM130F Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm
Tryptone Thermo Scientific Oxoid LP0042 500 g
Yeast extract Thermo Scientific Oxoid LP0021 500 g
Equipments
Biochemical incubator Blue pard LRH-70
Tanon 5200multi imaging system Tanon 5200CE
Thermostatic water bath Jinghong DK-S28

Referanslar

  1. Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
  2. Kaiser, D. Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns. Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).
  3. Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).
  4. Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P. Swarming motility in plant-associated bacteria. Hellenic Plant Protection Journal. 9 (1), 16-27 (2016).
  5. Jones, H. E., Park, R. W. The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus. Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).
  6. Su, C., et al. Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori. Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).
  7. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
  8. Funfhaus, A., et al. Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera). Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).
  9. Armbruster, C. E. Testing the ability of compounds to induce swarming. Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).
  10. Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium. Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).
  11. Ingham, C. J., Ben Jacob, E. Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells. BMC Microbiology. 8, 36 (2008).
  12. Shimada, H., et al. Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis. Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).
  13. Brahmachari, P. V., et al., Brahmachari, P. V., et al. Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria. Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. , 49-66 (2018).
  14. Lindum, P. W., et al. N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).
  15. Wang, W. B., et al. Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol. Journal of Medical Microbiology. 55, 1313-1321 (2006).
  16. Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli. Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).
  17. Kuchma, S. L., et al. Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator. Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).
  18. Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).
  19. Bru, J. L., Siryaporn, A., Høyland-Kroghsbo, N. M. Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).
  20. Hölscher, T., et al. Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).
  21. Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
  22. Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation. Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).
  23. Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles. Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).
  24. Kearns, D. B., Losick, R. Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).
  25. Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility. Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).
  26. Wang, S., et al. Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa. Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Guo, S., Liu, Z., Yang, Y., Chen, J., Ho, C. L. Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates. J. Vis. Exp. (179), e63382, doi:10.3791/63382 (2022).

View Video