Monitoreo dinámico de la seroconversión mediante un ensayo de inmunodaxia multianalto para Covid-19

Resultados típicos de ensayos y evaluaciones de rendimientoLos ensayos de immunobead comúnmente proporcionan una curva sigmoidal cuando se evalúan en varios (log) órdenes de magnitud, como se ilustra en cada uno de los paneles presentados en la Figura 1. El usuario debe definir experimentalmente el rango de concentración óptimo para cada analito en el múltiplex para determinar el rango completo de cuantificación, asegurando no muestrear en exceso los extremos (áreas que se acercan al límite inferior de cuantificación [LLOQ] o al límite superior de cuantificación [ULOQ]). El rango real requerido para un ensayo, sin embargo, está dictado por la distribución de los analitos objetivo en una matriz biológica (es decir, las “incógnitas”) en un factor de dilución dado. Además, aunque las curvas estándar se interpretan típicamente a través de la regresión lineal con un algoritmo de ajuste paramétrico 4 o 5, la porción lineal de una curva dada generalmente proporciona la mayor confianza en la precisión cuantitativa con un modelo lineal (y = mx + b) de cuantificación. Hacer coincidir la curva de calibración con los valores observados para un desconocido en un factor de dilución dado debe ser el objetivo en el desarrollo de ensayos cuantitativos. En este sentido, se evaluó una curva estándar de 7 puntos basada en una serie de dilución en serie 1:5 para cada uno de los anticuerpos Spike S1, Nucleocápside y Membrana que oscilan entre 1 μg/mL y 0.000064 μg/mL para Spike S1 y Nucleocápside y 5 μg/mL y 0.00032 μg/mL para Membrana, como se muestra en la Figura 1. El límite inferior de detección (LLOD) para cada ensayo se definió como la concentración más baja de analito que produjo una señal distinguible de su fondo. LLOD se puede identificar por la ecuación descrita anteriormente 8,9, LLOD = LoB + 1.645 (muestra debaja concentración SD). LoB es el límite inferior de espacio en blanco, y es la concentración “aparente” de analito que se produce a partir del espacio en blanco cuando se espera un valor cero, y se puede determinar utilizando esta ecuación LoB= Blanco medio + 1.645 (SDen blanco)8. Sobre la base de este método, los valores de IMF para el ensayo Spike S1 variaron de 134.38 a 20191.2, con 134.38 MFI que representan 0.00024 μg / mL y se definen como LLOD. Para el ensayo de membrana, el rango práctico de IMF fue de 52.24 a 4764.9, con 52.24 MFI calculado en 0.004885 μg / mL y asignado como LLOD. El rango de IMF para el ensayo de nucleocápside fue de 517.9 a 19666.34, con 517.9 especificado como 0.00024 μg / mL, que fue el LLOD. El límite superior de detección (ULOD) se define como la concentración de analito después de la cual el cambio en la IMF ya no es lineal y la respuesta de la señal está saturada. Cabe señalar que el carácter sigmoidal completo de estas curvas no es observable para los estándares probados, con la excepción de la curva de nucleocápside. Sin embargo, dado que los valores de IMF observados para todas las incógnitas ensayadas hasta la fecha (a una dilución de 1:500) están dentro del rango de curvas presentado para cada analito y se cuantifican fácilmente utilizando un ajuste paramétrico de 4 o 5 mediante regresión lineal. Precisión del ensayoPrecisión intraensayo: Se realizaron cuatro réplicas de ensayos en la misma placa para evaluar la precisión del ensayo, calculada como el %CV, o el cociente de la desviación estándar y el promedio multiplicado por 100. Se seleccionaron los puntos estándar 2 y 5 para estas tabulaciones, con valores catalogados en la Tabla 2. El umbral límite superior aceptable típico para los valores %CV es ≤20%, lo que se observó para estos datos, con la excepción del estándar 2 de IgG de membrana, que probablemente resulta de los niveles de fondo y puede rectificarse eliminando los valores periféricos (datos no mostrados). Cabe señalar que se observó una aparente inestabilidad para leer el valor para los ensayos de membrana donde los valores de IMF fueron <200, más comúnmente en el caso de los isotipos IgA e IgM. Precisión entre ensayos: Se prepararon tres lotes distintos de conjuntos de cuentas para cada ensayo y se probaron, según se define para la precisión intraensayo (arriba y como se ve en la Figura 1). La variabilidad entre ensayos se evaluó calculando el %CV a partir de los resultados medios para cada uno de los tres lotes, como se muestra en la Tabla 3. Una vez más, el umbral límite superior para un %CV aceptable se establece en ≤20%, que existe para todas las condiciones probadas (con un efecto similar con el estándar 2 de IgG de membrana, como se vio anteriormente). Cabe señalar que la variabilidad de lote a lote en los valores netos de IMF se observa comúnmente dentro de múltiples lotes de los mismos inmunorreagentes durante el desarrollo de ensayos personalizados. El uso de una curva de calibración erigida a partir de un anticuerpo anti-objetivo obtenido comercialmente (por ejemplo, conejo anti-Spike S1) seguido de un anticuerpo de detección anti-especie puede proporcionar consistencia en los resultados analíticos y permitir comparaciones entre múltiples lotes en diferentes períodos de tiempo. Precisión entre ensayos con muestras humanas: La evaluación de la precisión entre ensayos se repitió con muestras de plasma humano (n = 5) recogidas dentro de un mes de los primeros síntomas notificados de una infección por SARS-CoV-2; logrado con tres lotes distintos de ensayos (es decir, diferentes preparaciones de los conjuntos de cuentas). Estos resultados se muestran en la Tabla 4 y demuestran precisión con un valor %CV con el valor límite típico del umbral superior de ≤20%. Los valores promedio de %CV para los títulos de IgG de Pico S1, Nucleocápside y Membrana se calcularon en 9.9% (rango 2.6%-18%), 11.0% (rango 3.5%-24.4%) y 7.6% (rango 3.2%-12.9%), respectivamente. Se realizaron observaciones similares con los títulos de IgM e IgA de estos tres analitos, todos proporcionando valores %CV <20%. La única excepción a esto fueron los títulos de IgM del Sujeto 5 para la proteína de membrana, que posteriormente se excluyó como un valor atípico. Los valores de precisión para las evaluaciones de sujetos humanos son consistentes con los vistos anteriormente para los anticuerpos de conejo, lo que sugiere que estos ensayos pueden reconfigurarse fácilmente para evaluar títulos de los antígenos en múltiples especies con poco impacto en la precisión del ensayo. Como se señaló anteriormente, hubo una aparente inestabilidad para leer los valores observados para los ensayos de membrana donde los valores de MFI fueron <200, más comúnmente en el caso de los isotipos IgA e IgM. Optimización de la concentración de anticuerpos primariosEl “tiempo de captura” del analito se evaluó con las perlas conjugadas con antígenos, y los anticuerpos en las muestras de plasma o en los estándares se probaron modificando la duración de la incubación primaria (30 min, 1 h, 2 h y 4 h). La diferencia en la IMF media se presenta como el cociente de una incubación específica y el tiempo máximo de incubación, denominado % Máx., en la Figura 2, entre una incubación de 30 min (duración mínima) y una incubación de 4 h (duración máxima). Los valores a 120 min fueron óptimos para los títulos de IgG para los anticuerpos Spike S1, Membrane y Nucleocapsid, lo que indica una cinética de unión de anticuerpos primaria rápida, lo que permite flexibilidad para aumentar el rendimiento del ensayo. Sin embargo, se observaron cinéticas más lentas para los isotipos IgA e IgM (datos no mostrados), demostrando niveles máximos de captura en el punto de tiempo de 4 h, como se muestra en la Figura 2. En general, existe un equilibrio entre el acercamiento a la saturación del ensayo y la conveniencia práctica del tiempo para ejecutar cada ensayo cuando está en producción (para maximizar el rendimiento). Con esto, se observaron señales adecuadas para fines cuantitativos a tiempos mínimos de incubación de 30 min para IgG, 60 min para IgM y 120 min para IgA en estos hallazgos. Optimización de la concentración secundaria de anticuerposSe probaron cinco concentraciones de anticuerpos secundarios (IgG antihumano de cabra, PE conjugado; IgA antihumano de cabra, PE conjugado; IgM antihumano de cabra, SB conjugado) (0,5, 1, 2, 4 y 8 μg/ml). Todos los anticuerpos revelaron amplios rangos de señal, sin saturación de señal obvia en ninguna condición, lo que garantiza una medición lineal para cualquiera de las concentraciones. Como ejemplo, la señal promedio generada a partir del ensayo Spike S1 utilizando IgM antihumana de cabra, SB-conjugada a 0.5 μg / mL fue el 13.2% de la IMF generada a partir de la señal máxima (8 μg / mL), mientras que la IMF generada a partir de 4 μg / mL fue el 73.3% de la IMF manifestada en la señal máxima. Los detalles del rango de señales de los otros isotipos de anticuerpos Spike S1, los anticuerpos de membrana y los anticuerpos de nucleocápside se incluyen en la Tabla 5 y la Figura 3. Como punto práctico, el impacto primario entre la concentración óptima de anticuerpos secundarios y la concentración de anticuerpos secundarios de 4 μg/ml establecida anteriormente se refleja en términos de sensibilidad del ensayo y costo del ensayo. Es decir, una concentración secundaria de anticuerpos de 8 μg/ml puede ser deseable para la aplicación con títulos de anticuerpos bajos o bajas cantidades de muestra valiosa, pero el costo asociado con estos ensayos sería considerablemente mayor que el uso de la concentración de 4 μg/ml definida anteriormente. Inversamente, los casos en los que se observaran títulos altos de anticuerpos (como individuos que han experimentado vacunas contra covid-19 o con cantidades no limitantes de sueros) verían un costo-beneficio a través de la aplicación de las cantidades más bajas de anticuerpos secundarios (por ejemplo, 1 μg / ml). Optimización de la incubación secundaria de anticuerposTambién se investigó la influencia potencial de la duración de la incubación secundaria de anticuerpos modificando la duración de la incubación (15, 30, 60 y 120 min). En general, la diferencia en la IMF promedio presentada como el cociente de una incubación específica y el tiempo máximo de incubación, denominado %Max, entre una incubación de 15 minutos (duración mínima) y una incubación de 120 minutos (duración máxima) no superó el 30%, 55% y 50% para los anticuerpos Spike S1, Membrana y Nucleocápside, respectivamente, lo que indica un paso cinético rápido en la unión secundaria de anticuerpos y un medio para aumentar el rendimiento del ensayo. La Tabla 6 incluye detalles sobre los cambios de señal para todos los tiempos de incubación. Las ilustraciones de las señales observadas de diferentes incubaciones de este análisis se muestran en la Figura 4. Rendimiento y especificidad de doble canalPara cada analito, se comparó un solo formato de reportero (igG-PE solamente, igA-PE solamente o igM-SB solamente) con la señal generada para el mismo analito cuando se ejecutó en un formato de doble reportero (por ejemplo, Spike S1 IgG-PE solo versus Spike S1 IgG-PE en combinación con Spike S1 IgM-SB en el formato de doble reportero). La precisión del ensayo (expresada como %CV) para las señales creadas en los dos formatos se utilizó para analizar la relación en los hallazgos de este experimento. Los valores %CV de los ensayos Spike S1 fueron de 6,19%, 16,4% y 23% para IgM, IgG e IgA, respectivamente. Para el ensayo de membrana, los valores %CV fueron de 3,3%, 7,9% y 16,4% para IgM, IgG e IgA, respectivamente. Finalmente, el ensayo nucleocápside proporcionó valores %CV en 8.7%, 10.3% y 24.2% para IgM, IgG e IgA, respectivamente. Los valores de precisión observados para los isotipos IgM e IgA sugieren que un tiempo de incubación más largo puede conferir resultados de ensayo superiores debido a las diferencias cinéticas de unión conocidas entre estas clases de inmunoglobulinas. La Figura 4 muestra la concordancia entre los formatos de diferentes concentraciones de anticuerpos secundarios. Para confirmar la especificidad de los canales de reporteros, se probó un solo canal de reportero a la vez, mientras que el otro canal se asignó como un espacio en blanco para preguntar sobre la señal no específica (efecto de sangrado). Estos hallazgos indican que hay una contaminación insignificante de señal cruzada entre los dos canales de reportero, dada la alta especificidad en todo el espectro de condiciones. Estos hallazgos se ilustran en la Figura 5. En general, observamos una interferencia del 6,45% a través del canal 1 al canal 2. Sin embargo, cuando se tuvo en cuenta la magnitud de las señales, observamos los siguientes niveles potenciales de interferencia en modo de reportero dual: Spike IgG / IgM en 71.98%, Spike IgA / IgM en 28.11%; Membrana IgG/ IgM al 7,41%, Membrana IgA/IgM al 134,61%; y Nucleocápside IgG/IgM al 146,03%, Nucleocápside IgA/IgM al 112,13%. En la configuración especificada, esto requeriría la medición de Spike IgM en combinación con el isotipo IgA, IgM de membrana con el isotipo IgM y mediciones de nucleocápside no realizadas en un formato de doble canal. Este hallazgo puede requerir la exploración de la inversión de la estrategia de etiquetado mediante la cual se miden IgA e IgG en el canal 2 e IgM en el canal 1. Evaluación de eventos de seroconversión después de la vacunación contra el Covid-19La seroconversión se monitoreó en cuatro sujetos tras la evaluación de IgA, IgM e IgG con el ensayo Spike S1 en puntos de tiempo que van desde la prevacunación hasta cuatro meses después de la finalización de la serie de vacunación contra covid-19. Las mediciones se realizaron en modo de doble canal (IgG/IgM e IgA/IgM, con valores de IgM promediados). Todos los sujetos recibieron la vacuna como una inmunización de 2 etapas, según la práctica estándar, con un intervalo de 21 días entre la primera y la segunda dosis. Las gráficas de la respuesta inmune de cada sujeto se muestran en la Figura 6A-C. Los valores de respuesta inmune para los antígenos de nucleocápside y membrana se observaron en niveles de fondo para todas las inmunoglobulinas evaluadas (datos no mostrados), lo que fue consistente con los sujetos que no tenían ninguna infección previa documentada por SARS-CoV-2 en el tiempo anterior a la vacunación. En general, los valores observados de IgA e IgM de Spike S1 fueron aproximadamente 40 veces más bajos que los títulos de isotipo de IgG, con títulos máximos que alcanzaron su punto máximo tan pronto como 14 días para los isotipos igM e IgG y el isotipo IgA alcanzó títulos máximos entre el momento de la segunda dosis (día 0) y 14 días después de la segunda dosis, dependiendo del tema. En particular, los títulos de IgG Spike S1 comienzan a descomponerse durante el transcurso de los cuatro meses posteriores a la finalización de la vacunación a una tasa altamente variable, de una manera dependiente del sujeto. Figura 1: Curvas estándar representativas de 3 plexos. Curvas estándar representativas para los tres analitos; se presenta como una curva de dilución seriada de 7 puntos y 1:5 a partir de (A) 1 μg/mL para Spike S1, (B) 5 μg/mL para Membrane, y (C) 1 μg/mL para Nucleocapsid y anticuerpos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Optimización del tiempo de incubación de anticuerpos primarios/muestras: La señal promedio de IMF producida a partir de diferentes tiempos de incubación de anticuerpos primarios/muestras (captura de anticuerpos) que varía de 30 min a 4 h para los estándares 1-7 (como se indica en la Tabla 1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Optimizaciones de la concentración secundaria de anticuerpos y rendimiento de doble canal. Las curvas ilustran la IMF promedio (normalizada al valor más alto registrado en la serie) producida a partir de concentraciones de anticuerpos secundarios probados, que van desde 0.5-8 μg / ml. Cada instancia se realizó como un ensayo de canal único y doble para apreciar las diferencias en el formato experimental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Optimización del tiempo de incubación de anticuerpos secundarios, formato de doble canal. Gráficos representativos de los valores observados de IMF (normalizados al valor más alto registrado en la serie) con respecto al tiempo de incubación con anticuerpos secundarios. Los experimentos se realizaron como ensayos de doble canal como combinaciones (A-C) IgA/IgM o (D-F) IgG/IgM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Evaluaciones de especificidad para ensayos de doble canal. Resultados del ensayo del formato de ensayo de doble canal con una de cada combinación designada como espacio en blanco para ilustrar la falta de fluorescente o interferencia de canal cruzado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: Ilustración de la seroconversión después de la vacunación contra el Covid-19. Gráficos que ilustran los títulos relativos de (A) anticuerpos IgG, (B) IgM y (C) IgA para el antígeno Spike S1 durante el curso de la vacunación contra el Covid-19 (Prevacunación – 4 meses después de la finalización); el tiempo se muestra en días en relación con la finalización de la serie de vacunación; se indican los puntos generales de la administración de la vacuna (líneas rojas). Los experimentos se realizaron en modo de doble canal, como se describe en el Protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Número estándar Serie de dilución Anti-Spike S1 o N (μg/mL) Antimembrana (μg/mL) Espacio en blanco Espacio en blanco – – 1 ETS7 1:1 1 5 2 ETS6 1:5 0.2 1 3 ETS5 1:25 0.04 0.2 4 STD4 1:125 0.008 0.04 5 STD3 1:625 0.0016 0.008 6 STD2 1:3125 0.00032 0.0016 7 ETS1 1:15625 0.000064 0.00032 Tabla 1: Series de dilución para curvas estándar: Tabla de factores de dilución utilizados para las curvas estándar para el serotipo IgG; se presenta como una curva de dilución seriada de 7 puntos y 1:5 a partir de 1 μg/mL para α-Spike S1 y α-Nucleocápside y 5 μg/mL para anticuerpos de α membrana. Analito Muestra Representante 1 Representante 2 Representante 3 Representante 4 Ave Sd %CV Espiga S1 ETS2 369.4 356.9 295.2 271.5 323.3 47.4 14.6 ETS5 3869.1 3437 3970.2 4240.7 3879.3 334 8.6 Membrana ETS2 40.6 37.7 49.9 27.8 39 9.1 23.3 ETS5 733.2 731.3 724 678.1 716.7 26 3.6 Nucleocápside ETS2 1746.7 1790.8 1577.3 1664.8 1694.9 94.2 5.6 ETS5 15598.1 14735.5 18369.5 17408.5 16527.9 1657.7 10 Tabla 2: Precisión intraensayo: Coeficiente porcentual de varianza (%CV) calculado a partir de cuatro réplicas de mezclas de anticuerpos estándar en el estándar 2 (STD2) y el estándar 5 (STD5) con un solo lote de ensayo en el mismo experimento. Los valores proporcionados para las réplicas y los promedios representan los valores observados de la IMF. Analito Muestra Lote 1 Lote 2 Lote3 Ave Sd %CV Espiga S1 ETS2 383.2 424.4 379.9 395.8 24.8 6.3 ETS5 5639.7 6062.5 6384.3 6028.8 373.4 6.2 Membrana ETS2 39.1 58.5 59.1 52.2 11.4 21.8 ETS5 732.3 941.4 701.1 791.6 130.7 16.5 Nucleocápside ETS2 1342.6 1621 1718.2 1560.6 195 12.5 ETS5 13543.9 14843.2 17883.4 15423.5 2227.2 14.4 Tabla 3: Precisión entre ensayos con muestras estándar: Porcentaje de coeficiente de varianza (%CV) calculado a partir de tres lotes distintos de ensayos, evaluados en el estándar 2 y el estándar 5 en el mismo experimento. Los valores proporcionados para las réplicas y los promedios representan los valores observados de la IMF. IgG-PE IgM-SB IgA-PE Ave. MFI %CV Ave. MFI %CV Ave. MFI %CV Espiga S1 Tema 1 8002.3 17.7 1949.5 1.3 2045.8 5.5 Tema 2 19155.8 7.3 918.6 4.1 1684.5 3.9 Tema 3 17865.6 18.0 549.4 3.8 961.3 8.1 Tema 4 11901.1 2.6 1603 4.8 8736.4 5.5 Tema 5 9801.8 4.0 1014.1 3.0 2747.6 9.3 Nucleocápside Tema 1 15097.8 11.3 1049.7 9.9 5276.5 3.9 Tema 2 15204.3 12.1 265.9 5.2 6761.3 11.9 Tema 3 18471.7 24.4 329.1 4.5 14308 2.9 Tema 4 16424.7 3.5 2418.1 0.1 4234.7 4.2 Tema 5 13344.9 3.6 225.6 10.0 13436.5 9.7 Membrana Tema 1 514.6 8.6 180.6 14.0 141.2 9.8 Tema 2 196.8 5.2 57 20.7 55.5 13.0 Tema 3 553.7 12.9 54.5 21.2 191.2 18.6 Tema 4 377.9 3.2 68.1 22.1 62 2.3 Tema 5 325.4 8.2 11.4 91.6 74.6 20.8 Tabla 4: Precisión entre ensayos con muestras humanas: Porcentaje medio de coeficiente de varianza (%CV) calculado a partir de tres lotes de ensayos analizados con muestras de plasma (diluidas 500 veces) de cinco sujetos humanos con infecciones por SARS-CoV-2. Espiga S1 Membrana Nucleocápside μg/ml Ave. MFI % máx. Ave. MFI % máx. Ave. MFI % máx. Igm 0.5 186 13.2 32 25.2 132.7 13.6 1 304.2 21.6 45.8 36 194.4 19.9 2 664.5 47.2 78.8 61.9 458.2 47 4 1032.1 73.3 101.3 79.6 707.8 72.6 8 1407.1 100 127.2 100 975 100 IgG 0.5 809.7 4.9 27.5 15 1355.6 6.3 1 1696.9 10.2 40.6 22.2 2782.1 13 2 4543.8 27.3 68.3 37.3 6661.2 31.2 4 10003.5 60 110.7 60.5 12605.6 59 8 16662.8 100 182.9 100 21360.6 100 IgA 0.5 797.4 19.3 31.1 47.2 2056.5 16.1 1 1529.5 37 41.4 62.8 3869 30.4 2 2261.3 54.7 48.6 73.3 6648.9 52.2 4 2320.4 56.2 48.3 73.2 6548.1 51.4 8 4132.2 100 65.9 100 12744.8 100 Tabla 5: Optimización de la concentración secundaria de anticuerpos: La señal promedio de IMF producida a partir de diferentes concentraciones de anticuerpos secundarios oscila entre 0,5 μg/ml y 8 μg/ml. El valor de cada señal también se presenta como un porcentaje de la señal a 8 μg/mL (“Máx.”) para demostrar la magnitud relativa de la señal. Espiga S1 Membrana Nucleocápside Tiempo de incubación (mín.) Ave. MFI % máx. Ave. MFI % máx. Ave. MFI % máx. Igm 15 1185 72.2 40.4 48.9 609.5 53.3 30 1416.6 86.3 58.4 70.7 894.2 78.2 60 1324.8 80.7 73.6 89.1 945.6 82.7 120 1641.2 100 82.6 100 1143.2 100 IgG 15 12917.6 80.5 244.4 44.9 15429.8 80.8 30 14915.4 92.9 434.7 79.9 18797 98.5 60 15340.3 95.6 421.4 77.5 18694.4 97.9 120 16050.3 100 544 100 19085.8 100 IgA 15 3141.9 78.2 75 66.8 9103 86.6 30 3569.1 88.8 83.9 74.8 9563.8 91 60 3539.1 88 86 76.6 9555.7 90.9 120 4020 100 112.2 100 10512.9 100 Tabla 6: Optimización del tiempo de incubación de anticuerpos secundarios: La señal promedio de IMF producida a partir de diferentes tiempos de incubación de anticuerpos secundarios varía de 15 min a 120 min. El valor de cada señal también se representa como un porcentaje de la señal a 120 min (“Max.”) para demostrar la magnitud relativa de la señal.