Covid-19の多検体免疫ビーズアッセイを使用した血清変換の動的モニタリング

典型的なアッセイ結果と性能評価イムノビーズアッセイは、 図1に示す各パネルに示されているように、一般に、数(対数)桁にわたって評価すると、シグモイド曲線を提供します。ユーザーは、マルチプレックス内の各分析物の最適濃度範囲を実験的に定義して定量の全範囲を決定し、極端な値(定量の下限[LLOQ]または定量上限[ULOQ]に近づく領域)を過剰にサンプリングしないようにする必要があります。しかし、アッセイに必要な実際の範囲は、所定の希釈因子における生物学的マトリックス(すなわち、「未知数」)中の標的分析物の分布によって決定される。さらに、標準曲線は通常、4パラメトリックまたは5パラメトリック適合アルゴリズムを使用した線形回帰によって解釈されますが、所与の曲線の線形部分は、通常、線形(y = mx + b)定量モデルを用いて定量精度に最大の信頼を提供します。検量線を所定の希釈係数における未知物の観察値と一致させることが、定量アッセイ開発の目標であるべきです。 この点に関して、スパイクS1、ヌクレオカプシド、およびメンブレン抗体のそれぞれについて、スパイクS1およびヌクレオカプシドについては1μg/mL~0.000064μg/mL、メンブレンでは5μg/mLおよび0.00032μg/mLの範囲の1:5段階希釈系列に基づく7点標準曲線を評価しました(図1に示すように)。各アッセイの検出下限(LLOD)は、そのバックグラウンドと区別できるシグナルを生じた最低の分析物濃度として定義した。LLODは、前述の式8、9、LLOD=LoB+1.645(SD低濃度試料)により同定することができる。LoBはブランクの下限であり、ゼロ値が予想される場合にブランクから生成される分析物の「見かけ上の」濃度であり、この式LoB = 平均ブランク+ 1.645(SDブランク)8を使用して確認することができます。この方法に基づいて、スパイクS1アッセイのMFI値は134.38~20191.2の範囲であり、134.38MFIは0.00024μg/mLを表し、LLODとして定義されました。メンブレンアッセイの場合、実用的なMFI範囲は52.24~4764.9で、52.24MFIは0.004885μg/mLと計算され、LLODとして割り当てられました。ヌクレオカプシドアッセイのMFI範囲は517.9~19666.34で、517.9は0.00024μg/mLと指定されており、これはLLODでした。検出上限(ULOD)は、MFIの変化が線形でなくなり、シグナル応答が飽和した後の分析物の濃度として定義されます。これらの曲線の完全なシグモイド特性は、Nucleocapsid曲線を除いて、試験された標準では観察できないことに留意すべきである。ただし、現在までにアッセイされたすべての未知数(1:500希釈時)について観察されたMFI値は、各分析物について提示された曲線範囲内にあり、線形回帰による4または5パラメトリックフィットを使用して容易に定量化できます。 アッセイ精度アッセイ内精度:アッセイの4回の反復を同じプレート上で実施し、%CV、または標準偏差と平均の商に100を掛けた値として計算されたアッセイ精度を評価しました。これらの表に対して標準点 2 と 5 が選択され、表 2 に値がカタログ化されています。%CV値の典型的な許容上限閾値は≤20%であり、これはMembrane IgGの標準2のそれを除いて、これらのデータについて観察されたが、これはバックグラウンドレベルに起因する可能性が高く、外れた値を排除することによって修正することができる(データは示されていない)。MFI値が<200であったメンブレンアッセイでは、読み取り値に対する明らかな不安定性が観察されたこと(IgAおよびIgMアイソタイプの場合に最も一般的であることに留意すべきである。 アッセイ間精度:各アッセイについて3つの異なるバッチのビーズセットを調製し、アッセイ内精度について定義したとおりに試験しました(上記および図1に見られるように)。アッセイ間変動性は、表3に示すように、3つのバッチの各々についての平均結果から%CVを計算することによって評価した。ここでも、許容可能な%CVの上限閾値は≤20%に設定されており、これは試験したすべての条件に対して存在する(上記のように、Membrane IgGの標準2と同様の効果を有する)。正味MFI値のバッチ間変動性は、カスタムアッセイ開発中に同じ免疫試薬の複数のバッチ内で一般的に観察されることに留意すべきである。商業的に入手した抗標的抗体(例えば、ウサギ抗スパイクS1)から構築された検量線とそれに続く抗種検出抗体の使用は、分析結果に一貫性を提供し、異なる期間における複数のバッチ間の比較を可能にすることができる。 ヒトサンプルとのアッセイ間精度:アッセイ間精度の評価は、SARS-CoV-2感染について最初に報告された症状から1ヶ月以内に収集されたヒト血漿サンプル(n = 5)を用いて繰り返した。アッセイの3つの異なるバッチ(すなわち、ビーズセットの異なる調製物)で達成される。これらの結果を表 4 に示し、%CV 値と一般的な上限値が ≤20% の精度を示しています。スパイクS1、ヌクレオカプシドおよびメンブレンIgG力価の平均%CV値は、それぞれ9.9%(範囲2.6%〜18%)、11.0%(範囲3.5%〜24.4%)、および7.6%(範囲3.2%〜12.9%)であると計算された。これら3つの分析物のIgMおよびIgA力価についても同様の観察が行われ、いずれも%CV値<20%であった。これに対する唯一の例外は、膜タンパク質に対する被験者5 IgM力価であり、その後、外れ値として除外された。ヒト被験者評価の精度値は、ウサギ抗体について上記で見られたものと一致しており、これは、アッセイの精度にほとんど影響を及ぼさずに複数の種における抗原の力価を評価するために、これらのアッセイを容易に再構成され得ることを示唆している。上記のように、MFI値が<200であったメンブレンアッセイ(IgAおよびIgMアイソタイプの場合に最も一般的)で観察された読み取り値に明らかな不安定性があった。 一次抗体濃度の最適化分析物の「捕捉時間」を抗原結合ビーズで評価し、血漿検体または標準物質中の抗体を、一次インキュベーションの長さ(30分、1時間、2時間、および4時間)を変更することによって試験した。平均MFIの差は、特定のインキュベーションの商として表され、 図2では、30分のインキュベーション(最小持続時間)と4時間のインキュベーション(最大持続時間)の間の最大インキュベーション時間(% Max)と呼ばれる。120 分での値は、スパイク S1、メンブレン、およびヌクレオカプシド抗体の IgG 力価に最適であり、高速一次抗体結合動態を示し、アッセイスループットを向上させる柔軟性を可能にしました。しかし、IgAおよびIgM(データは示さず)アイソタイプについてより遅い動態が観察され、 図2に示すように、4時間時点におけるピーク捕捉レベルが実証された。全体として、アッセイの飽和に近づくことと、生産時に各アッセイを実行するための実用的な時間の便宜性(スループットを最大化するため)との間にはバランスがあります。これにより、これらの知見において、IgGについて30分、IgMについて60分、およびIgAについて120分の最小インキュベーション時間で定量目的に適したシグナルが観察された。 二次抗体濃度の最適化5つの濃度の二次抗体(ヤギ抗ヒトIgG、PEコンジュゲート;ヤギ抗ヒトIgA、PEコンジュゲート;ヤギ抗ヒトIgM、SBコンジュゲート)を試験した(0.5、1、2、4、および8μg/mL)。すべての抗体は、広範囲のシグナルを明らかにし、いかなる条件においても明らかなシグナル飽和を伴わず、それによって、任意の濃度について線形測定を確実にした。一例として、0.5μg/mLでSBコンジュゲートしたヤギ抗ヒトIgMを用いたスパイクS1アッセイから生成された平均シグナルは、最大シグナル(8μg/mL)から生成されたMFIの13.2%であったのに対し、4μg/mLから生成されたMFIは、最大シグナルで発現したMFIの73.3%であった。他のスパイクS1抗体アイソタイプ、メンブレン抗体、およびヌクレオカプシド抗体からのシグナルの範囲の詳細は、 表5 および 図3に含まれる。実用的なポイントとして、最適な二次抗体濃度と前述の4μg/mL二次抗体濃度との間の主要な影響は、アッセイ感度とアッセイコストの点で反映されています。つまり、8 μg/mL の二次抗体濃度は、低い抗体価または少量の貴重なサンプルでの適用には望ましい場合がありますが、これらのアッセイに関連するコストは、以前に定義された 4 μg/mL 濃度の使用よりもかなり高くなります。逆に、高い抗体価が観察される場合(Covid-19ワクチン接種を経験した個人や非限定的な量の血清を有する個人など)は、より低い量の二次抗体(例えば、1μg/mL)の適用を通じて費用便益を得るであろう。 二次抗体インキュベーションの最適化二次抗体インキュベーションの持続時間の潜在的な影響も、インキュベーションの長さ(15、30、60、および120分)を改変することによって調査した。一般に、15分間のインキュベーション(最小持続時間)と120分間のインキュベーション(最大持続時間)との間の、特定のインキュベーションおよび最大インキュベーション時間の商として提示される平均MFIの差は、スパイクS1、メンブレン、およびヌクレオカプシド抗体についてそれぞれ30%、55%、および50%を超えず、二次抗体結合における速い動態学的ステップを示し、アッセイスループットを増加させることを意味する。 表6は 、すべてのインキュベーション時間におけるシグナル変化の詳細を含む。この分析の異なるインキュベーションから観察されたシグナルの図を 図4に示す。 デュアルチャネル性能と特異性各分析物について、単一のレポーターフォーマットの実行(IgG-PEのみ、IgA-PEのみ、またはIgM-SBのみ)を、デュアルレポーターフォーマット(例えば、デュアルレポーターフォーマットのスパイクS1 IgM-SBと組み合わせたスパイクS1 IgG-PEのみ対スパイクS1 IgG-PE)で実行したときに同じ分析物に対して生成されたシグナルと比較した。2つのフォーマットで作成されたシグナルのアッセイ精度(%CVとして表される)を用いて、この実験の結果における関係を分析した。スパイクS1アッセイの%CV値は、IgM、IgG、およびIgAについてそれぞれ6.19%、16.4%、および23%であった。メンブレンアッセイの場合、%CV値は、IgM、IgG、およびIgAについてそれぞれ3.3%、7.9%、および16.4%であった。最後に、ヌクレオカプシドアッセイは、IgM、IgG、およびIgAについてそれぞれ8.7%、10.3%、および24.2%の%CV値を提供しました。IgM および IgA アイソタイプについて観察された精度値は、より長いインキュベーション時間が、これらのクラスの免疫グロブリンにわたる既知の結合速度論的差異のために、優れたアッセイ結果を与える可能性があることを示唆しています。 図4 は、異なる濃度の二次抗体のフォーマット間の一致を示す。 レポーターチャネルの特異性を確認するために、単一のレポーターチャネルを一度に試験し、他方のチャネルをブランクとして割り当てて、非特異的シグナル(出血効果)について問い合わせた。これらの知見は、条件のスペクトルにわたって高い特異性を考えると、2つのレポーターチャネル間に交差シグナル汚染が無視できる程度であることを示している。これらの知見を 図5に示す。全体として、チャネル1からチャネル2にかけて6.45%の干渉が観察されました。しかし、信号の大きさを考慮すると、デュアルレポーターモードで次の潜在的な干渉レベルが観察されました:スパイクIgG / IgMは71.98%、スパイクIgA / IgMは28.11%です。膜IgG/IgMは7.41%、膜IgA/IgMは134.61%;ヌクレオカプシドIgG/IgMは146.03%、ヌクレオカプシドIgA/IgMは112.13%であった。指定された構成では、スパイク IgM を IgA アイソタイプと組み合わせて測定すること、IgM アイソタイプと膜 IgM を併用すること、およびデュアルチャネル形式では実行しないヌクレオカプシド測定が必要になります。この知見は、IgAとIgGをチャネル2で、IgMをチャネル1で測定するという標識戦略の逆転の調査を必要とする可能性がある。 Covid-19ワクチン接種後の血清変換イベントの評価血清変換は、ワクチン接種前からCovid-19ワクチン接種シリーズの完了後4ヶ月までの時点で、スパイクS1アッセイによるIgA、IgM、およびIgGの評価時に4人の被験者でモニターされました。測定はデュアルチャネルモード(IgG/IgMおよびIgA/IgM、IgM値を平均)で行った。すべての被験者は、標準診療に従って、第1回投与と第2回投与の間に21日間の間隔で、2段階の免疫としてワクチンを受けた。各被験者の免疫応答のプロットを 図6A〜Cに示す。NucleocapsidおよびMembrane抗原に対する免疫応答値は、評価されたすべての免疫グロブリンについてバックグラウンドレベルで観察され(データは示さず)、これはワクチン接種前の時間に文書化された以前のSARS−CoV−2感染を有していない被験者と一致した。全体として、観察されたスパイクS1 IgAおよびIgM値は、IgGアイソタイプ力価よりも約40倍低く、IgMおよびIgGアイソタイプおよびIgAアイソタイプの両方についてピーク力価が14日後にピーク力価に達し、2回目の投与(0日目)から2回目の投与後14日目の間にピーク力価に達し、 主題に応じて。特に、スパイクS1 IgG力価は、ワクチン接種完了後4ヶ月間に、被験者依存的に、非常に変動する速度で減衰し始める。 図1:代表的な3-プレックス標準曲線3つの分析物の代表的な標準曲線;スパイクS1については(A)1μg/mL、メンブレンでは5μg/mL、ヌクレオカプシドおよび抗体では1μg/mLから始まる7点、1:5の段階希釈曲線として提示した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図2:一次抗体/サンプルのインキュベーション時間の最適化:標準物質1~7について、30分から4時間の範囲の一次抗体/サンプルの異なるインキュベーション時間(抗体捕捉)から生成される平均MFIシグナル(表1に示されています)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図3:二次抗体濃度の最適化とデュアルチャネル性能 曲線は、試験済みの二次抗体濃度から生成された平均MFI(シリーズで最も高い記録値に正規化)を示しており、0.5~8μg/mLの範囲です。各インスタンスをシングルチャネルアッセイおよびデュアルチャネルアッセイの両方として実施し、実験フォーマットの違いを評価しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図4:二次抗体のインキュベーション時間最適化、デュアルチャネルフォーマット。 二次抗体とのインキュベーション時間に関して観察されたMFI値(シリーズで最も高い記録値に正規化された)の代表的なプロット。実験は、(A-C)IgA/IgMまたは(D-F)IgG/IgMの組み合わせとしてデュアルチャネルアッセイとして実施された。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図5:デュアルチャネルアッセイの特異性評価 ブランクとして指定された各組み合わせの1つを用いたデュアルチャネルアッセイフォーマットのアッセイ結果は、クロスチャネル蛍光または干渉の欠如を例示する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図6:Covid-19ワクチン接種後の血清変換の図。Covid-19ワクチン接種(ワクチン接種前 – 完了後4ヶ月)の期間中のスパイクS1抗原に対する(A)IgG、(B)IgM、および(C)IgA抗体の相対力価を示すプロット。時間は、ワクチン接種シリーズの完了に対して日数で示される。ワクチン投与の一般的な点が示されている(赤い線)。実験は、議定書に記載されているように、デュアルチャネルモードで実施した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 標準番号 希釈シリーズ アンチスパイク S1 または N (μg/mL) アンチメンブレン(μg/mL) 空砲 空砲 – – 1 STD7 1:1 1 5 2 STD6 1:5 0.2 1 3 STD5 1:25 0.04 0.2 4 STD4 1:125 0.008 0.04 5 STD3 1:625 0.0016 0.008 6 STD2 1:3125 0.00032 0.0016 7 STD1 1:15625 0.000064 0.00032 表1:標準曲線の希釈系列: IgG血清型の標準曲線に用いた希釈係数の表;α-スパイクS1およびα-ヌクレオカプシドでは1 μg/mL、α-メンブレン抗体では5 μg/mLから始まる7点、1:5の段階希釈曲線として提示されました。 分析物 見本 担当者 1 担当者 2 担当者 3 担当者 4 アベニュー ティッカー %履歴書 スパイクS1 ティッカー 369.4 356.9 295.2 271.5 323.3 47.4 14.6 ティッカー 3869.1 3437 3970.2 4240.7 3879.3 334 8.6 膜 ティッカー 40.6 37.7 49.9 27.8 39 9.1 23.3 ティッカー 733.2 731.3 724 678.1 716.7 26 3.6 ヌクレオカプシド ティッカー 1746.7 1790.8 1577.3 1664.8 1694.9 94.2 5.6 ティッカー 15598.1 14735.5 18369.5 17408.5 16527.9 1657.7 10 表2:アッセイ内精度: 同じ実験における単一のアッセイバッチを用いた標準2(STD2)および標準5(STD5)における標準抗体混合物の4回の反復から計算されたパーセント分散係数(%CV)。反復と平均に提供される値は、観測されたMFI値を表します。 分析物 見本 バッチ 1 バッチ 2 バッチ 3 アベニュー ティッカー %履歴書 スパイクS1 ティッカー 383.2 424.4 379.9 395.8 24.8 6.3 ティッカー 5639.7 6062.5 6384.3 6028.8 373.4 6.2 膜 ティッカー 39.1 58.5 59.1 52.2 11.4 21.8 ティッカー 732.3 941.4 701.1 791.6 130.7 16.5 ヌクレオカプシド ティッカー 1342.6 1621 1718.2 1560.6 195 12.5 ティッカー 13543.9 14843.2 17883.4 15423.5 2227.2 14.4 表3:標準サンプルによるアッセイ間精度: パーセント分散係数(%CV)は、アッセイの3つの異なるバッチから計算し、同じ実験において標準2および標準5で評価した。反復と平均に提供される値は、観測されたMFI値を表します。 IgG-PE IgM-SB IgA-PE アベニュー MFI %履歴書 アベニュー MFI %履歴書 アベニュー MFI %履歴書 スパイクS1 件名 1 8002.3 17.7 1949.5 1.3 2045.8 5.5 件名2 19155.8 7.3 918.6 4.1 1684.5 3.9 科目3 17865.6 18.0 549.4 3.8 961.3 8.1 科目4 11901.1 2.6 1603 4.8 8736.4 5.5 科目5 9801.8 4.0 1014.1 3.0 2747.6 9.3 ヌクレオカプシド 件名 1 15097.8 11.3 1049.7 9.9 5276.5 3.9 件名2 15204.3 12.1 265.9 5.2 6761.3 11.9 科目3 18471.7 24.4 329.1 4.5 14308 2.9 科目4 16424.7 3.5 2418.1 0.1 4234.7 4.2 科目5 13344.9 3.6 225.6 10.0 13436.5 9.7 膜 件名 1 514.6 8.6 180.6 14.0 141.2 9.8 件名2 196.8 5.2 57 20.7 55.5 13.0 科目3 553.7 12.9 54.5 21.2 191.2 18.6 科目4 377.9 3.2 68.1 22.1 62 2.3 科目5 325.4 8.2 11.4 91.6 74.6 20.8 表4:ヒトサンプルとのアッセイ間精度: SARS-CoV-2感染を有する5人のヒト被験者からの血漿サンプル(500倍に希釈)で試験したアッセイの3つのバッチから計算された平均パーセント分散係数(%CV)。 スパイクS1 膜 ヌクレオカプシド ミリグラム/ミリリットル アベニュー MFI % 最大。 アベニュー MFI % 最大。 アベニュー MFI % 最大。 ティッカー 0.5 186 13.2 32 25.2 132.7 13.6 1 304.2 21.6 45.8 36 194.4 19.9 2 664.5 47.2 78.8 61.9 458.2 47 4 1032.1 73.3 101.3 79.6 707.8 72.6 8 1407.1 100 127.2 100 975 100 ティッカー 0.5 809.7 4.9 27.5 15 1355.6 6.3 1 1696.9 10.2 40.6 22.2 2782.1 13 2 4543.8 27.3 68.3 37.3 6661.2 31.2 4 10003.5 60 110.7 60.5 12605.6 59 8 16662.8 100 182.9 100 21360.6 100 イガ 0.5 797.4 19.3 31.1 47.2 2056.5 16.1 1 1529.5 37 41.4 62.8 3869 30.4 2 2261.3 54.7 48.6 73.3 6648.9 52.2 4 2320.4 56.2 48.3 73.2 6548.1 51.4 8 4132.2 100 65.9 100 12744.8 100 表5:二次抗体濃度の最適化: 0.5 μg/mL ~ 8 μg/mL の範囲の異なる濃度の二次抗体から生成される平均 MFI シグナル。各信号の値は、相対的な信号の大きさを示すために、8μg/mL(「最大」)での信号の割合としても表されます。 スパイクS1 膜 ヌクレオカプシド インキュベーション時間(分) アベニュー MFI % 最大。 アベニュー MFI % 最大。 アベニュー MFI % 最大。 ティッカー 15 1185 72.2 40.4 48.9 609.5 53.3 30 1416.6 86.3 58.4 70.7 894.2 78.2 60 1324.8 80.7 73.6 89.1 945.6 82.7 120 1641.2 100 82.6 100 1143.2 100 ティッカー 15 12917.6 80.5 244.4 44.9 15429.8 80.8 30 14915.4 92.9 434.7 79.9 18797 98.5 60 15340.3 95.6 421.4 77.5 18694.4 97.9 120 16050.3 100 544 100 19085.8 100 イガ 15 3141.9 78.2 75 66.8 9103 86.6 30 3569.1 88.8 83.9 74.8 9563.8 91 60 3539.1 88 86 76.6 9555.7 90.9 120 4020 100 112.2 100 10512.9 100 表6:二次抗体インキュベーション時間の最適化: 二次抗体の異なるインキュベーション時間から産生される平均MFIシグナルは、15分から120分の範囲である。各信号の値は、相対的な信号の大きさを示すために、120分における信号のパーセンテージ(「最大」)としても表されます。