Özet

トリパノソーマ・クルジまたは他の病原性生物由来のDNAを検出するためのすぐに使用できるqPCR

Published: January 20, 2022
doi:

Özet

本研究では、反応容器にプリロードして冷蔵庫に数ヶ月間保存できる 、T. cruzi DNA検出用のすぐに使用できるqPCRを製造するための手順について説明します。

Abstract

リアルタイムPCR(qPCR)は、多数のサンプルから微量の核酸ターゲットを増幅できる、非常に高感度で正確な技術です。多くの研究分野で広く使用されており、遺伝子組み換え生物(GMO)作物の作物におけるヒト診断や形質選択などの分野での産業応用を達成しています。ただし、qPCRはエラー防止技術ではありません。すべての試薬を1つのマスターミックスに混合し、その後通常のqPCRプレートの96ウェルに分配すると、試薬の誤った混合やウェルへの不正確な分注などのオペレーターミスにつながる可能性があります。ここでは、ゲル化と呼ばれる技術が提示されており、マスターミックスに存在する水の大部分は、真空に提出されたときにゾル-ゲル混合物を形成する試薬によって置換されます。その結果、qPCR試薬は室温で数週間、または2〜8 °Cで数ヶ月間効果的に保存されます。 各溶液の調製の詳細は、T. cruzi 衛星DNA(satDNA)を検出するために設計されたゲル化反応の予想される側面とともにここに示されています。同様の手順を他の生物の検出にも適用できます。ゲル化qPCRランの開始は、プレートを冷蔵庫から取り出し、サンプルをそれぞれのウェルに追加し、ランを開始するのと同じくらい簡単で、フルプレート反応のセットアップ時間をサンプルのロードにかかる時間に短縮します。さらに、ゲル化PCR反応はバッチで製造および品質を制御できるため、時間を節約し、ルーチンPCR反応を実行する際の一般的なオペレーターのミスを回避できます。

Introduction

シャーガス病は、貧困が蔓延していたブラジルの農村地域で20世紀初頭に発見されました1,2今日でも、この病気は南北アメリカの健康の社会的および経済的決定要因に関連し続けています。シャーガス病は二相性で、急性期と慢性期で構成されています。これは、トリパノソーマクルジ寄生虫による感染、昆虫ベクターによる感染、先天性経路を介した輸血、または汚染された食品の経口摂取によって引き起こされます3,4

シャーガス病の診断は、臨床症状(特にロマーニャ徴候)の観察、血液塗抹顕微鏡検査、血清学、およびリアルタイムPCR(qPCR)または等温増幅4,5,6,7,8,9などの分子検査によって行うことができます。臨床症状と血液塗抹顕微鏡検査は急性感染症の疑いのある症例に使用されますが、抗体の検索は無症候性患者のスクリーニングツールとして使用されます。qPCRは、その感度と特異性から、慢性患者のモニタリングツール、血液中の寄生虫負荷を測定する治療を受けている急性患者、および治療失敗の代理マーカーとして使用することが示唆されています6,8,10,11,12 .qPCRは、現在利用可能な検査よりも感度が高く特異的ですが、輸送および保管のための凍結温度の要件により、世界中の恵まれない地域では診断ツールとして知られることを効果的に妨げられています13,14,15

この障害を回避するために、凍結乾燥やゲル化などの保存技術が検討されている16,17。凍結乾燥は何年にもわたって保存を提供しますが、酵素の安定化/保存に一般的に使用されるグリセロールの存在なしに特別に作られた試薬を必要とします18。ゲル化は数ヶ月間の保存を提供することが示されているが、それは通常の試薬の使用を可能にする19。ゲル化溶液は4つの成分を含み、それぞれがプロセスにおいて特定の役割を有する:糖トレハロースおよびメレジトースは、溶液中の遊離水分子を減少させることによって乾燥プロセス中に生体分子を保護し、グリコーゲンはより広い保護マトリックスを生成し、アミノ酸リジンは、生体分子のカルボキシル間の酸化反応を阻害するフリーラジカルスカベンジャーとして使用される。 アミノ基およびリン酸基。これらの成分は、乾燥プロセス中の三次または四次構造の喪失を防ぐゾル-ゲル混合物を定義し、したがって、再水和時に生体分子の活性を維持するのに役立ちます19。反応管内で安定化したら、反応物を通常の-20°Cではなく21-23°Cで2-8°Cで数ヶ月間、または数週間保存することができます。 このアプローチは、シャーガス病、マラリア、リーシュマニア症、結核、シクロスポリア症などの疾患の診断に役立つように設計されたテストにすでに組み込まれています13141520

本研究では、ゲル化手順に必要な溶液を調製するためのすべてのステップ、プロセスの落とし穴、および8チューブストリップ内のすぐに使用できるゲル化qPCRの予想される最終側面について説明します。同じプロトコルをシングルチューブまたは96ウェルプレートに適合させることができます。最後に、 T. cruzi DNAの検出がコントロールランとして示されます。

Protocol

1.原液およびゲル化混合物の調製 注:4つのストック溶液(400 mg / mLのメレジトース、400 mg / mLのトレハロース、0.75 mg / mLのリジン、および200 mg / mLのグリコーゲン)を調製し、 表1 に示す割合に従って混合してゲル化混合物を生成します。プロトコルには10 mLのストック溶液の生産が記載されていますが、少量または多量に適合させることができます。<…

Representative Results

ゲル化混合物を形成する3つの試薬は、激しいボルテックスで容易に可溶化されます。ただし、グリコーゲンは、粉末が完全に可溶化されていることを確認するために慎重なボルテックスを必要とします。残念ながら、激しい渦流は大量の気泡を生成するため、溶液の実際の体積を決定することは困難です(図1A-B)。したがって、気泡内に閉じ込?…

Discussion

近年、熱帯病や顧みられない病気の診断に役立つ、より感度が高く具体的な技術を見つける必要性が浮き彫りになっています。疫学的管理には重要ですが、寄生虫学的(光学顕微鏡検査)および血清学的検査には、特に感度とポイントオブケアの適用性に関して制限があります。PCR、等温増幅、およびそれぞれのバリエーションなどのDNA増幅技術は、実験室の設定で長い間使用されてきました?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、真空オーブンの技術支援を提供してくれたAline Burda Farias氏と、同機器へのアクセスを許可してくれたパラナ分子生物学研究所(IBMP、クリチバ、ブラジル)の管理に感謝の意を表したいと思います。この作業は、助成金CNPq 445954 / 2020-5によって部分的に資金提供されました。

Materials

Bentonite clay bags (activated) Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain) 026157/STD Not to be confused with silica gel packs
Glycogen Amersham Bioscience Cat# US16445
Lysine Acros Organic Cat# 365650250
Melezitoze Sigma-Aldrich Cat# 63620
Nuclease-free water preferred vendor
Oligonucleotides preferred vendor
PCR mastermix preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brazil) Chagas NAT kit
PCR thermocycler preferred vendor
software for vacuum oven Memmert Gmbh Celsius v10.0
Trehalose Sigma-Aldrich Cat# T9531
Trypanosoma cruzi DNA from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC
Vacuum oven Memmert Gmbh VO-400

Referanslar

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Bu Makaleden Alıntı Yapın
Costa, A. D. T., Amadei, S. S., Bertão-Santos, A., Rodrigues, T. Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms. J. Vis. Exp. (179), e63316, doi:10.3791/63316 (2022).

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