顆粒細胞前駆体における原発性シリウム依存シグナル伝達経路を研究するための効率的で費用対効果の高いエレクトロポレーション法

小脳GCPは、生体内のHhシグナル伝達経路に対する高い存在量と高感度性のために、ニューロン前駆細胞型におけるHhシグナル伝達経路の機械を研究するために広く使用^{されています}。GCPにおいて、一次シリウムは、前駆細胞^6,7,8の増殖を調整する極めて重要なHhシグナル伝達ハブ⁵として機能^する。一次シリウム上のHhシグナル伝達成分のインビジュアライゼーションは、内因性の基底レベルが低いため、しばしば困難です。したがって、目的の遺伝子のタンパク質発現レベルおよびフルオロフォアタグ付けの遺伝子導入修飾は、分子分解能で経路を研究するのに有用なアプローチである。しかし、リポソームベースのトランスフェクションアプローチを用いたGCP一次培養の遺伝子操作は、トランスフェクション効率が低いことが多く、さらなる分子調査を妨げる^9。エレクトロポレーションは効率を高めるが、一般的には法外なベンダー固有および細胞型制限型エレクトロポレーション試薬¹⁰を必要とする。

本論文では、GCP一次培養におけるHhシグナル伝達経路成分を操作するための高効率かつ費用対効果の高いエレクトロポレーション法を紹介する。この改変エレクトロポレーションプロトコルを用いて、緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付きスムージングトランスジーン(pEGFP-Smo)をGCPに効率よく送達し、高い細胞生存率とトランスフェクション率(80~90%)を達成しました。さらに、免疫細胞化学的染色によって証明されるように、トランスフェクトGCPは、EGFP-Smoをプライマリ繊毛に密売することによってHhシグナル伝達経路のSmoothedアゴニスト誘発活性化に対して高い感受性を示した。このプロトコルは、ヒトおよびげっ歯類の一次細胞培養、ならびにヒト人工多能性幹細胞など、トランスフェクトが困難な細胞型の インビトロ 遺伝子改変を伴う実験に対して直接的に適用され、有益である。