In vitro Detección de drogas contra todas las etapas del ciclo de vida de Trypanosoma cruzi utilizando parásitos que expresan β-galactosidasa

La enfermedad de Chagas (ChD), o tripanosomiasis americana, es una enfermedad parasitaria causada por el protozoo flagelado, Trypanosoma cruzi (T. cruzi). La enfermedad coronaria comienza con una fase aguda asintomática u oligosintomática que generalmente no se diagnostica, seguida de una fase crónica de por vida. En la cronicidad, ~ 30% de los pacientes manifiestan, décadas después de la infección, una variedad de afecciones debilitantes, que incluyen miocardiopatía, síndromes megadigestivos o ambos, con una tasa de mortalidad que oscila entre el 0,2% y el 20%^1,2,3. Los pacientes crónicos asintomáticos pueden no tener signos clínicos, pero permanecen seropositivos durante toda su vida.

Las estimaciones sugieren que ~ 7 millones de personas están infectadas en todo el mundo, principalmente de América Latina, donde la enfermedad coronaria es endémica. En estos países, T. cruzi se transmite principalmente a través de insectos triatominos chupadores de sangre infectados (transmisión transmitida por vectores) y con menos frecuencia por transmisión oral a través de la ingestión de alimentos contaminados con heces de triatominos que contienen los parásitos². Además, el parásito puede transmitirse a través de la placenta de las madres chagásicas a los recién nacidos, a través de transfusiones de sangre o durante el trasplante de órganos. Estas formas independientes del vector de adquirir la infección y la migración humana han contribuido a la propagación mundial de la enfermedad, evidenciada por un número creciente de casos en América del Norte, Europa y algunos países de África, el Mediterráneo oriental y el Pacífico occidental⁴. La enfermedad coronaria se considera una enfermedad desatendida, ya que la transmisión transmitida por vectores está estrechamente asociada con la pobreza y es un problema de salud pública líder, especialmente en los países latinoamericanos de bajos ingresos. Aunque existen tratamientos disponibles, la mortalidad por ChD en América Latina es la más alta entre las enfermedades parasitarias, incluida la malaria².

Hay dos medicamentos registrados para el tratamiento de chD introducidos a fines de la década de 1960 y principios de la década de 1970: nifurtimox y benznidazol⁵. Ambos medicamentos son efectivos en la fase aguda de la enfermedad en adultos, niños y recién nacidos infectados congénitamente, así como en niños con infección crónica, donde generalmente se logra la curación. Sin embargo, solo unas pocas personas son diagnosticadas lo suficientemente temprano como para ser tratadas a tiempo. Según los últimos ensayos clínicos, ambos fármacos tienen importantes limitaciones en adultos y fueron ineficaces para reducir los síntomas en personas con enfermedades crónicas; por lo tanto, su uso en esta etapa es controvertido. Otros inconvenientes son los períodos de tratamiento prolongados requeridos (60-90 días) y los efectos adversos frecuentes y graves observados, que conducen a la interrupción de la terapia en una proporción de personas infectadas ^6,7. Se estima que menos del 10% de las personas con cardiopatía coronaria han sido diagnosticadas, y aún menos tienen acceso al tratamiento, ya que muchas personas afectadas viven en áreas rurales con acceso nulo o escaso a la atención médica⁸. Estos hechos ponen de relieve la necesidad urgente de encontrar nuevos fármacos contra T. cruzi que permitan tratamientos más eficientes, seguros y aplicables al campo, especialmente para la fase crónica. En este sentido, otro desafío en el desarrollo de compuestos más eficaces es la limitación de los sistemas para evaluar la eficacia de los fármacos in vitro e in vivo⁹.

Aunque la biología química y los enfoques genómicos para la identificación de posibles objetivos farmacológicos se han utilizado en parásitos cinetoplastidos, las herramientas genómicas disponibles en T. cruzi son limitadas en contraste con T. brucei o Leishmania. Por lo tanto, el cribado de compuestos con actividad tripanocida sigue siendo el enfoque más utilizado en la búsqueda de nuevos candidatos a fármacos quimioterapéuticos contra la Enfermedad Coronaria. Por lo general, el descubrimiento de fármacos en T. cruzi debe comenzar con la prueba de los efectos de un nuevo fármaco en un ensayo in vitro contra la etapa de epimastigote. Durante décadas, la única forma de medir los efectos inhibitorios de los compuestos candidatos en T. cruzi fue el conteo microscópico manual, que es laborioso, lento y dependiente del operador. Además, este enfoque es adecuado para el ensayo de un pequeño número de compuestos, pero es inaceptable para el cribado de alto rendimiento de grandes bibliotecas de compuestos. Hoy en día, muchas investigaciones comienzan con el análisis de una gran cantidad de compuestos de diferentes orígenes que se ensayan in vitro, probando su capacidad para inhibir el crecimiento de parásitos. Se han desarrollado métodos colorimétricos y fluorométricos para aumentar el rendimiento en estos ensayos, mejorando la objetividad del cribado y haciendo que todo el proceso sea menos tedioso⁹.

Uno de los métodos colorimétricos más utilizados se basa en la actividad β-galactosidasa de parásitos transfectados descritos por primera vez por Bucknet y colaboradores¹⁰. La enzima β-galactosidasa expresada por los parásitos recombinantes hidroliza el sustrato cromogénico, clorofenol rojo β-D-galactopiranosido (CPRG), a rojo clorofenol, que se puede medir fácilmente colorimétricamente utilizando un espectrofotómetro de microplacas. Por lo tanto, el crecimiento del parásito en presencia de una variedad de compuestos se puede evaluar y cuantificar simultáneamente en placas de microtitulación. Este método se ha aplicado para probar fármacos en formas de epimastigote (presentes en el insecto vector), tripomastigotes y amastigotes intracelulares, las etapas mamíferas del parásito. Además, ya están disponibles varias cepas recombinantes de T. cruzi transfectadas con el plásmido pBS:CL-Neo-01/BC-X-10 (pLacZ)¹⁰ para expresar la enzima Escherichia coli β-galactosidasa (y se pueden construir otras nuevas), lo que permite la evaluación de parásitos a partir de diferentes unidades de tipificación discreta (DTU) que pueden no comportarse igualmente hacia los mismos compuestos 10,11,12,13 . Este método ya se ha utilizado con éxito para evaluar la actividad de los compuestos contra T. cruzi en el cribado de bajo y alto rendimiento^12,13. Enfoques similares también se han utilizado en otros parásitos protozoarios, incluyendo Toxoplasma gondii y Leishmania mexicana^14,15.

Este artículo describe y muestra un método detallado para un cribado de fármacos in vitro contra todas las etapas del ciclo de vida de T. cruzi utilizando parásitos que expresan β-galactosidasa. Los ensayos aquí presentados se han realizado con una línea de T. cruzi que expresa β-galactosidasa obtenida por transfección de la cepa T. cruzi Dm28c de DTU I¹³ con plásmido pLacZ (Dm28c/pLacZ). Además, el mismo protocolo podría adaptarse fácilmente a otras cepas para comparar el rendimiento entre compuestos y entre cepas de T. cruzi o DTU.