Preparación de bicapas lipídicas soportadas por perlas para estudiar la producción de partículas de las sinapsis inmunes de células T

La sinapsis inmunológica (IS) es una estructura molecular fundamental formada en la interfaz de las células que participan en contacto físico que facilita el intercambio regulado de información de yuxtracrina. Se han descrito diferentes IS en la literatura, y un creciente cuerpo de evidencia sugiere que estos centros moleculares son una característica conservada de las redes celulares. Varias células inmunes, incluidas las células B, las células asesinas naturales, las células dendríticas, los macrófagos y las células T, intercambian información a través del ensamblaje de contactos de corta ^duración1. Los estudios multiómicos están avanzando en la comprensión de nuevos subconjuntos de leucocitos y células estromales que impulsan las redes celulares patógenas y expresan proteínas de superficie con funciones desconocidas. Como APC sintéticos, los BSLB permiten la investigación directa del papel funcional de las proteínas individuales en la integración de señales activadoras, a saber, antígenos y coestimulación/ corepresión, por parte de las células T y la liberación resultante de partículas efectoras denominadas señal cuatro.

Este documento describe los protocolos y los puntos técnicos críticos a considerar al usar BSLB para imitar la composición superficial de los APC modelo. Los protocolos para la medición cuantitativa de los receptores inmunes y otras proteínas de superficie en los APC se presentan junto con el protocolo para la reconstitución de apces sintéticos que contienen estas cantidades medidas. Luego, se presentan los pasos necesarios para coculturizar células T y BSLB junto con el protocolo para la medición cuantitativa de la transferencia transsináptica de partículas mediante citometría de flujo. Lo más notable es que los BSLB facilitan el estudio de una población de tSV derivada de la membrana plasmática denominada ectosomas sinápticos (SE). Los SE enriquecidos con receptores de antígenos de células T (TCR⁺) se eliminan en respuesta a la activación de ^TCR2 y son capturados eficientemente por BSLBs3, lo que representa una excelente lectura para evaluar las propiedades agonísticas de los antígenos y la composición de la membrana modelada. Los exosomas CD63⁺ y las partículas de ataque supramolecular (SMAP) también son liberados por las células T estimuladas y capturados por los BSLB. Se pueden utilizar como lecturas adicionales de la activación y la secreción de gránulos exocíticos y líticos resultante por las células T. La movilización de vesículas exocitíticas al polo que interactúa de la célula T también facilita la liberación direccional de citoquinas, como IL-2, IFN-γ e IL-10 en respuesta a la activación4,5,6,7,8. Aunque las citoquinas liberadas por células T también se pueden detectar en BSLB, actualmente se está desarrollando un estudio más dedicado para validar el análisis cuantitativo de la liberación de citoquinas en la sinapsis inmunológica.

Para interrogar cómo las composiciones específicas de la membrana influyen en la producción sináptica de las células T se requiere definir la densidad fisiológica del componente de membrana objetivo. Las cuantificaciones basadas en citometría de flujo de proteínas de superficie celular son un paso esencial en este protocolo y requieren: 1) el uso de anticuerpos con números conocidos de fluorocromos por anticuerpo (F / P), y 2) perlas de referencia que proporcionen una referencia estándar para interpolar moléculas de fluorocromo a partir de intensidades de fluorescencia medias (IMF) medidas.

Estos estándares de referencia consisten en cinco poblaciones de perlas, cada una de las cuales contiene un número creciente de fluorocromos solubles equivalentes (MESF), que abarcan el rango dinámico de detección de fluorescencia arbitraria. Estas poblaciones estándar producen picos de fluorescencia discretos, lo que facilita la conversión de unidades de fluorescencia arbitrarias en MESF mediante regresión lineal simple. Los MESF resultantes se utilizan junto con los valores de anticuerpos F / P para calcular el número promedio de moléculas unidas por célula (o BSLB en pasos posteriores). La aplicación de las áreas de superficie celular estimadas al número promedio de moléculas detectadas permite el cálculo de densidades fisiológicas como moléculas/^μm2. Este protocolo de cuantificación también se puede adaptar a la medición de densidades de proteínas en células T y a la reconstitución bioquímica de composiciones de membrana que median la formación de sinapsis homotípicas de células T (es decir, sinapsis ^T-T9). Si es necesario, la valencia de la unión a anticuerpos se puede estimar aún más mediante el uso de objetivos recombinantes marcados con números conocidos de fluorocromos por molécula. Luego, la valencia de unión a anticuerpos se puede calcular para la misma población de BSLB comparando simultáneamente el número de proteínas fluorescentes unidas y anticuerpos de cuantificación (utilizando dos fluorocromos de cuantificación diferentes y estándares MESF).

La reconstitución de membranas APC requiere el ensamblaje de bicapas lipídicas soportadas (SLB) sobre perlas de ^sílice1. Las existencias de liposomas que contienen diferentes especies de fosfolípidos se pueden aprovechar para formar una matriz lipídica-bicapa versátil, lo que permite el anclaje de proteínas recombinantes con diferente química de unión (la preparación de los liposomas se detalla en ¹⁰). Una vez que se define la densidad fisiológica (o densidades) del ligando relevante “en las células”, se adapta el mismo protocolo de citometría de flujo para estimar la concentración de proteína recombinante necesaria para recubrir los BSLB con la densidad fisiológica objetivo. Se pueden utilizar dos sistemas de anclaje diferentes en combinación o por separado.

En primer lugar, el SLB que contiene un 12,5 mol% final de fosfolípidos que contienen ^Ni2+ es suficiente para proporcionar aproximadamente 10.000 sitios de unión a la etiqueta His por micra ^cuadrada10 y funciona bien para decorar los BSLB con la mayoría de las proteínas disponibles comercialmente cuyas densidades fisiológicas no exceden esta capacidad de carga máxima. El segundo sistema de carga aprovecha los fosfolípidos que contienen biotina (como mol%) para cargar anti-CD3e Fab biotinilado (o monómeros HLA / MHC) a través de puentes de estreptavidina. La combinación de estos dos métodos de decoración BSLB permite la adaptación flexible de BSLB como APC sintéticos. Para composiciones superficiales de APC altamente complejas, el mol% de fosfolípidos y proteínas se puede aumentar para cargar tantas proteínas como la pregunta en cuestión requiera. Una vez que se definen las concentraciones de trabajo de proteínas y mol% de fosfolípidos biotinilados, los BSLB se pueden ensamblar para interrogar la salida sináptica de las células T con citometría de flujo multiparamétrica.