Preparação de Bicamadas lipídicas apoiadas por contas para estudar a saída de partículas de sinapses imunes de células T

A sinapse imunológica (IS) é uma estrutura molecular fundamental formada na interface de células envolvidas em contato físico que facilita a troca regulada de informações juxtracrinas. Diferentes ISs foram descritos na literatura, e um conjunto crescente de evidências sugere que esses hubs moleculares são uma característica conservada das redes celulares. Várias células imunes, incluindo células B, células assassinas naturais, células dendríticas, macrófagos e células T, trocam informações através da montagem de contatos de curta ^duração1. Estudos multiómicos estão avançando na compreensão de novos subconjuntos de leucócitos e células estromais que conduzem redes celulares patogênicas e expressam proteínas superficiais com funções desconhecidas. Como APCs sintéticos, os BSLBs permitem a investigação direta do papel funcional das proteínas individuais na integração de sinais de ativação, ou seja, antígenos e costimulação/corepressão, por células T e a consequente liberação de partículas de efeitos referidas como sinal quatro.

Este artigo descreve os protocolos e pontos técnicos críticos a serem considerados ao usar BSLBs para imitar a composição superficial dos APCs do modelo. Os protocolos para a medição quantitativa de receptores imunológicos e outras proteínas superficiais em APCs são apresentados juntamente com o protocolo para a reconstituição de APCs sintéticos contendo essas quantidades medidas. Em seguida, as etapas necessárias para coculturar células T e BSLB são apresentadas juntamente com o protocolo para a medição quantitativa da transferência de partículas trans-sinápticas usando citometria de fluxo. Mais notavelmente, os BSLBs facilitam o estudo de uma população derivada de membrana plasmática de tSVs denominadas ectomosse sináptico (ECtos). As SEs enriquecidas com receptor de antígeno de células T (TCR⁺) são lançadas em resposta ao Acionamento ^TCR2 e capturadas eficientemente por BSLBs3, representando uma excelente leitura para avaliar as propriedades agonizantes dos antígenos e a composição da membrana modelada. Exosomos CD63⁺ e partículas de ataque supramolecular (SMAPs) também são liberados por células T estimuladas e capturados por BSLBs. Eles podem ser usados como leituras adicionais da ativação e a secreção de grânulo exolítico e lítico resultante por células T. A mobilização de vesículas exocióticas ao polo interagente da célula T também facilita a liberação direcional de citocinas, como IL-2, IFN-γ e IL-10 em resposta à ativação4,5,6,7,8. Embora citocinas liberadas por células T também possam ser detectadas em BSLBs, um estudo mais dedicado está atualmente em desenvolvimento para validar a análise quantitativa da liberação de citocinas na sinapse imunológica.

Para questionar como as composições de membranas específicas influenciam a saída sináptica das células T requer a definição da densidade fisiológica do componente da membrana alvo. Quantificações baseadas em citometria de fluxo de proteínas superficiais celulares são um passo essencial neste protocolo e exigem: 1) o uso de anticorpos com números conhecidos de fluorochromes por anticorpo (F/P), e 2) contas de referência fornecendo uma referência padrão para interpolar moléculas fluorocromáticas a partir de intensidades de fluorescência média medida (MFIs).

Esses padrões de referência consistem em cinco populações de contas, cada uma contendo um número crescente de fluorocromes solúveis equivalentes (MESFs), que abrangem a faixa dinâmica de detecção arbitrária de fluorescência. Essas populações padrão produzem picos de fluorescência discreta, facilitando a conversão de unidades de fluorescência arbitrária em MESFs por simples regressão linear. Os MESFs resultantes são então usados juntamente com valores de anticorpos F/P para calcular o número médio de moléculas ligadas por célula (ou BSLB em etapas posteriores). A aplicação de áreas estimadas da superfície celular ao número médio de moléculas detectadas permite então o cálculo de densidades fisiológicas como moléculas/^μm2. Este protocolo de quantificação também pode ser adaptado à medição de densidades proteicas em células T e à reconstituição bioquímica de composições de membrana mediando a formação de sinapses celulares T homotípicas (ou seja, sinapses ^T-T). Se necessário, a valência da ligação de anticorpos pode ser estimada usando alvos recombinantes rotulados com números conhecidos de fluorochromes por molécula. Em seguida, a valência de ligação de anticorpos pode ser calculada para a mesma população BSLB, comparando simultaneamente o número de proteínas fluorescentes ligadas e anticorpos de quantificação (usando dois fluorochromes de quantificação diferentes e padrões MESF).

A reconstituição das membranas APC requer a montagem de bicamadas lipídicas suportadas (SLBs) em contas de ^sílica1. Os estoques lipossomos contendo diferentes espécies fosfolipídicas podem ser aproveitados para formar uma versátil matriz lipídica-bicamada, permitindo a ancoragem de proteínas recombinantes com diferentes químicas de ligação (a preparação de lipossomos é detalhada em ¹⁰). Uma vez definida a densidade fisiológica (ou densidades) do ligante relevante “sobre células”, o mesmo protocolo de citometria de fluxo é adaptado para estimar a concentração de proteína recombinante necessária para cobrir BSLBs com a densidade fisiológica alvo. Dois sistemas de ancoragem diferentes podem ser usados em combinação ou separadamente.

Primeiro, o SLB contendo 12,5% finais de fosfolipídios contendo ^Ni2+, é suficiente para fornecer aproximadamente 10.000 locais de ligação de sua etiqueta por ^micron10 quadrado e funciona bem para decorar BSLBs com a maioria das proteínas disponíveis comercialmente cujas densidades fisiológicas não excedem essa capacidade máxima de carregamento. O segundo sistema de carregamento aproveita fosfolipídios contendo biotina (como mol) para carregar os monomers anti-CD3e fab biotinilados (ou monômeros HLA/MHC) através de pontes streptavidinas. A combinação desses dois métodos de decoração BSLB permite, então, a alfaiataria flexível de BSLBs como APCs sintéticos. Para composições superficiais APC altamente complexas, o mol% de fosfolipídios e proteínas pode ser aumentado para carregar quantas proteínas a questão em questão exige. Uma vez definidas as concentrações de trabalho de proteínas e mol% de fosfolipídios biotinilados, os BSLBs podem ser montados para interrogar a saída sináptica de células T com citometria de fluxo multiparamétrico.