Preparazione di doppi strati lipidici supportati da perline per studiare la produzione di particolato delle sinapsi immunitarie delle cellule T

La sinapsi immunologica (IS) è una struttura molecolare cardine formata all’interfaccia di cellule impegnate nel contatto fisico che facilita lo scambio regolato di informazioni juxtracrine. Diversi IS sono stati descritti in letteratura e un numero crescente di prove suggerisce che questi hub molecolari sono una caratteristica conservata delle reti cellulari. Varie cellule immunitarie, tra cui cellule B, cellule natural killer, cellule dendritiche, macrofagi e cellule T, si scambiano informazioni attraverso l’assemblaggio di contatti di breve ^durata1. Studi multiomici stanno facendo progredire la comprensione di nuovi sottoinsiemi di leucociti e cellule stromali che guidano reti cellulari patogene ed esprimono proteine di superficie con funzioni sconosciute. Come APC sintetici, i BSLB consentono lo studio diretto del ruolo funzionale delle singole proteine nell’integrazione dei segnali attivanti, vale a dire antigeni e costimolazione/corepressione, da parte delle cellule T e il conseguente rilascio di particelle effettrici denominate segnale quattro.

Questo documento descrive i protocolli e i punti tecnici critici da considerare durante l’utilizzo dei BSLB per imitare la composizione superficiale degli APC modello. I protocolli per la misurazione quantitativa dei recettori immunitari e di altre proteine di superficie sulle APC sono presentati insieme al protocollo per la ricostituzione di APC sintetici contenenti queste quantità misurate. Quindi, i passaggi necessari per la coculturazione delle cellule T e BSLB vengono presentati insieme al protocollo per la misurazione quantitativa del trasferimento di particelle trans-sinaptiche utilizzando la citometria a flusso. Più sorprendentemente, i BSLB facilitano lo studio di una popolazione di TSV derivati dalla membrana plasmatica chiamati ectosomi sinaptici (SE). Le SE arricchite con recettore dell’antigene delle cellule T (TCR⁺) vengono eliminate in risposta all’attivazione del ^TCR2 e catturate in modo efficiente dai BSLB3, rappresentando un’eccellente lettura per valutare le proprietà agonistiche degli antigeni e la composizione della membrana modellata. Gli esosomi CD63⁺ e le particelle di attacco supramolecolare (SMAP) vengono anche rilasciati dalle cellule T stimolate e catturati dai BSLB. Possono essere utilizzati come letture aggiuntive dell’attivazione e della conseguente secrezione di granuli esocitici e litici da parte delle cellule T. La mobilizzazione delle vescicole esocitiche al polo interagente della cellula T facilita anche il rilascio direzionale di citochine, come IL-2, IFN-γ e IL-10 in risposta all’attivazione4,5,6,7,8. Sebbene le citochine rilasciate dalle cellule T possano essere rilevate anche sui BSLB, uno studio più dedicato è attualmente in fase di sviluppo per convalidare l’analisi quantitativa del rilascio di citochine nella sinapsi immunologica.

Per interrogarsi su come specifiche composizioni di membrana influenzano l’output sinaptico delle cellule T è necessario definire la densità fisiologica della componente della membrana bersaglio. Le quantificazioni basate sulla citometria a flusso delle proteine di superficie cellulare sono un passo essenziale in questo protocollo e richiedono: 1) l’uso di anticorpi con un numero noto di fluorocromi per anticorpo (F / P) e 2) perline di riferimento che forniscono un riferimento standard per l’interpolazione di molecole di fluorocromo da intensità medie di fluorescenza misurate (MFI).

Questi standard di riferimento sono costituiti da cinque popolazioni di perline, ciascuna contenente un numero crescente di fluorocromi solubili equivalenti (MESF), che coprono la gamma dinamica di rilevamento arbitrario della fluorescenza. Queste popolazioni standard producono picchi di fluorescenza discreti, facilitando la conversione di unità di fluorescenza arbitrarie in MESF mediante semplice regressione lineare. I MESF risultanti vengono quindi utilizzati insieme ai valori degli anticorpi F / P per calcolare il numero medio di molecole legate per cellula (o BSLB nelle fasi successive). L’applicazione di aree di superficie cellulare stimate al numero medio di molecole rilevate consente quindi il calcolo delle densità fisiologiche come molecole/^μm2. Questo protocollo di quantificazione può anche essere adattato alla misurazione delle densità proteiche sulle cellule T e alla ricostituzione biochimica delle composizioni di membrana che mediano la formazione di sinapsi omotipiche delle cellule T (cioè le sinapsi ^T-T9). Se necessario, la valenza del legame anticorpale può essere ulteriormente stimata utilizzando bersagli ricombinanti etichettati con un numero noto di fluorocromi per molecola. Quindi, la valenza legante gli anticorpi può essere calcolata per la stessa popolazione BSLB confrontando contemporaneamente il numero di proteine fluorescenti legate e gli anticorpi di quantificazione (utilizzando due diversi fluorocromi di quantificazione e standard MESF).

La ricostituzione delle membrane APC richiede l’assemblaggio di doppi strati lipidici supportati (SLB) su perle di ^silice1. Gli stock di liposomi contenenti diverse specie di fosfolipidi possono essere sfruttati per formare una matrice lipidico-bistrato versatile, consentendo l’ancoraggio di proteine ricombinanti con una diversa chimica di legame (la preparazione dei liposomi è dettagliata in ¹⁰). Una volta definita la densità fisiologica (o densità) del ligando pertinente “sulle cellule”, lo stesso protocollo di citometria a flusso viene adattato per stimare la concentrazione di proteina ricombinante necessaria per rivestire i BSLB con la densità fisiologica target. Due diversi sistemi di ancoraggio possono essere utilizzati in combinazione o separatamente.

In primo luogo, SLB contenente un ultimo 12,5 mol% di fosfolipidi contenenti ^Ni2+ è sufficiente a fornire circa 10.000 siti di legame His-tag per micron ^quadrato10 e funziona bene per decorare BSLB con la maggior parte delle proteine disponibili in commercio le cui densità fisiologiche non superano questa capacità di carico massima. Il secondo sistema di carico sfrutta i fosfolipidi contenenti biotina (come mol%) per caricare i biotinilati anti-CD3e Fab (o monomeri HLA / MHC) tramite ponti di streptavidina. La combinazione di questi due metodi di decorazione BSLB consente quindi la personalizzazione flessibile dei BSLB come APC sintetici. Per composizioni superficiali APC altamente complesse, il mol% di fosfolipidi e proteine può essere aumentato per caricare tutte le proteine richieste dalla domanda in questione. Una volta definite le concentrazioni di lavoro delle proteine e il mol% dei fosfolipidi biotinilati, i BSLB possono essere assemblati per interrogare l’output sinaptico delle cellule T con citometria a flusso multiparametrica.