Herstellung von perlengestützten Lipiddoppelschichten zur Untersuchung der partikulären Ausscheidung von T-Zell-Immunsynapsen

Die immunologische Synapse (IS) ist eine zentrale molekulare Struktur, die an der Schnittstelle von Zellen gebildet wird, die in physischem Kontakt stehen und den regulierten Austausch von Juxtracrin-Informationen erleichtern. Verschiedene ISs wurden in der Literatur beschrieben, und eine wachsende Zahl von Beweisen deutet darauf hin, dass diese molekularen Zentren ein konserviertes Merkmal zellulärer Netzwerke sind. Verschiedene Immunzellen, darunter B-Zellen, natürliche Killerzellen, dendritische Zellen, Makrophagen und T-Zellen, tauschen Informationen über den Aufbau kurzlebiger Kontakte ^aus1. Multiomische Studien fördern das Verständnis neuartiger Untergruppen von Leukozyten und Stromazellen, die pathogene zelluläre Netzwerke antreiben und Oberflächenproteine mit unbekannten Funktionen exprimieren. Als synthetische APCs erlauben BSLBs die direkte Untersuchung der funktionellen Rolle einzelner Proteine bei der Integration von aktivierenden Signalen, nämlich Antigenen und Kostimulation/Corepression, durch T-Zellen und die daraus resultierende Freisetzung von Effektorpartikeln, die als Signal vier bezeichnet werden.

In diesem Dokument werden die Protokolle und kritischen technischen Punkte beschrieben, die bei der Verwendung von BSLBs zur Nachahmung der Oberflächenzusammensetzung von Modell-APCs zu berücksichtigen sind. Die Protokolle für die quantitative Messung von Immunrezeptoren und anderen Oberflächenproteinen auf APCs werden zusammen mit dem Protokoll für die Rekonstitution synthetischer APCs, die diese gemessenen Größen enthalten, vorgestellt. Anschließend werden die schritte, die für die Kokulturation von T-Zellen und BSLB erforderlich sind, zusammen mit dem Protokoll für die quantitative Messung des transsynaptischen Partikeltransfers mittels Durchflusszytometrie vorgestellt. Am bemerkenswertesten ist, dass BSLBs die Untersuchung einer aus der Plasmamembran abgeleiteten Population von tSVs erleichtern, die als synaptische Ektosomen (SEs) bezeichnet werden. T-Zell-Antigenrezeptor-angereicherte (TCR⁺) SEs werden als Reaktion auf TCR-Triggerung2 abgestoßen und effizient von BSLBs3 abgefangen, was eine hervorragende Ablesung darstellt, um die agonistischen Eigenschaften von Antigenen und die modellierte Membranzusammensetzung zu bewerten. CD63^+-Exosomen und supramolekulare Angriffspartikel (SMAPs) werden ebenfalls von stimulierten T-Zellen freigesetzt und von BSLBs eingefangen. Sie können als zusätzliche Auslesungen der Aktivierung und der daraus resultierenden exozytären und lytischen Granulensekretion durch T-Zellen verwendet werden. Die Mobilisierung exozytärer Vesikel zum interagierenden Pol der T-Zelle erleichtert auch die direktionale Freisetzung von Zytokinen wie IL-2, IFN-γ und IL-10 als Reaktion auf die Aktivierung4,5,6,7,8. Obwohl T-Zell-freigesetzte Zytokine auch auf BSLBs nachgewiesen werden können, befindet sich derzeit eine speziellere Studie in der Entwicklung, um die quantitative Analyse der Zytokinfreisetzung an der immunologischen Synapse zu validieren.

Um zu untersuchen, wie spezifische Membranzusammensetzungen die synaptische Leistung von T-Zellen beeinflussen, muss die physiologische Dichte der Zielmembrankomponente definiert werden. Durchflusszytometrie-basierte Quantifizierungen von Zelloberflächenproteinen sind ein wesentlicher Schritt in diesem Protokoll und erfordern: 1) die Verwendung von Antikörpern mit bekannter Anzahl von Fluorochromen pro Antikörper (F / P) und 2) Benchmark-Kügelchen, die eine Standardreferenz für die Interpolation von Fluorochrommolekülen aus gemessenen mittleren Fluoreszenzintensitäten (MFIs) darstellen.

Diese Benchmark-Standards bestehen aus fünf Perlenpopulationen, die jeweils eine zunehmende Anzahl äquivalenter löslicher Fluorochrome (MESFs) enthalten, die den Dynamikbereich der willkürlichen Fluoreszenzdetektion abdecken. Diese Standardpopulationen liefern diskrete Fluoreszenzpeaks, die die Umwandlung beliebiger Fluoreszenzeinheiten in MESFs durch einfache lineare Regression erleichtern. Die resultierenden MESFs werden dann zusammen mit Antikörper-F/P-Werten verwendet, um die durchschnittliche Anzahl der gebundenen Moleküle pro Zelle (oder BSLB in späteren Schritten) zu berechnen. Die Anwendung der geschätzten Zelloberflächen auf die durchschnittliche Anzahl der nachgewiesenen Moleküle ermöglicht dann die Berechnung physiologischer Dichten als Moleküle/^μm2. Dieses Quantifizierungsprotokoll kann auch an die Messung von Proteindichten auf T-Zellen und die biochemische Rekonstitution von Membranzusammensetzungen angepasst werden, die die Bildung homotypischer T-Zell-Synapsen (d.h. T-T-Synapsen9) vermitteln. Bei Bedarf kann die Wertigkeit der Antikörperbindung weiter geschätzt werden, indem rekombinante Targets verwendet werden, die mit einer bekannten Anzahl von Fluorochromen pro Molekül markiert sind. Dann kann die Antikörper-bindende Valenz für die gleiche BSLB-Population berechnet werden, indem gleichzeitig die Anzahl der gebundenen fluoreszierenden Proteine und Quantifizierungsantikörper verglichen wird (unter Verwendung von zwei verschiedenen Quantifizierungsfluorochromen und MESF-Standards).

Die Rekonstitution von APC-Membranen erfordert die Montage von gestützten Lipiddoppelschichten (SLBs) auf Silica-Perlen1. Liposomenbestände, die verschiedene Phospholipidspezies enthalten, können zu einer vielseitigen Lipid-Doppelschicht-Matrix genutzt werden, die die Verankerung rekombinanter Proteine mit unterschiedlicher Bindungschemie ermöglicht (die Herstellung von Liposomen ist in ^{10 beschrieben}). Sobald die physiologische Dichte (oder Dichte) des relevanten Liganden “auf Zellen” definiert ist, wird das gleiche Durchflusszytometrieprotokoll angepasst, um die Konzentration des rekombinanten Proteins abzuschätzen, das benötigt wird, um BSLBs mit der physiologischen Zieldichte zu beschichten. Zwei verschiedene Verankerungssysteme können entweder in Kombination oder separat verwendet werden.

Erstens reicht SLB, das die letzten 12,5 Mol-% ^Ni2+-haltiger Phospholipide enthält, aus, um etwa 10.000 His-Tag-Bindungsstellen pro ^{Quadratmikron10} bereitzustellen, und eignet sich gut, um BSLBs mit den meisten kommerziell erhältlichen Proteinen zu dekorieren, deren physiologische Dichten diese maximale Beladungskapazität nicht überschreiten. Das zweite Ladesystem nutzt biotinhaltige Phospholipide (als mol%), um biotinylierte Anti-CD3e Fab (oder HLA /MHC-Monomere) über Streptavidinbrücken zu laden. Die Kombination dieser beiden BSLB-Dekorationsmethoden ermöglicht dann die flexible Anpassung von BSLBs als synthetische APCs. Bei hochkomplexen APC-Oberflächenzusammensetzungen kann der Mol-Anteil an Phospholipiden und Proteinen erhöht werden, um so viele Proteine zu laden, wie die vorliegende Frage erfordert. Sobald die Arbeitskonzentrationen von Proteinen und Mol-% biotinylierter Phospholipide definiert sind, können BSLBs zusammengestellt werden, um die synaptische Leistung von T-Zellen mit multiparametrischer Durchflusszytometrie zu abfragen.