Özet

Voorbereiding van door kralen ondersteunde lipide bilayers om de deeltjesoutput van T-cel immuunsynapsen te bestuderen

Published: April 01, 2022
doi:

Özet

Hier presenteren we het protocol voor de stapsgewijze reconstitutie van synthetische antigeen-presenterende cellen met behulp van Bead-Supported Lipid Bilayers en hun gebruik om de synaptische output van geactiveerde T-cellen te ondervragen.

Abstract

Antigeen-presenterende cellen (APC’s) presenteren drie activerende signalen aan T-cellen die betrokken zijn bij fysiek contact: 1) antigeen, 2) costimulatie / corepressie en 3) oplosbare cytokines. T-cellen geven twee soorten effectordeeltjes af als reactie op activering: trans-synaptische blaasjes (tSV’s) en supramoleculaire aanvalsdeeltjes, die respectievelijk intercellulaire boodschappers overbrengen en cytotoxiciteit bemiddelen. Deze entiteiten worden snel geïnternaliseerd door APC’s die fysiek contact hebben met T-cellen, waardoor hun karakterisering ontmoedigend is. Dit artikel presenteert het protocol om Bead-Supported Lipid Bilayers (BSLBs) te fabriceren en te gebruiken als antigeen-presenterende cel (APC) mimetica om deze trans-synaptische deeltjes te vangen en te analyseren. Ook worden de protocollen beschreven voor de absolute metingen van eiwitdichtheden op celoppervlakken, de reconstitutie van BSLBs met dergelijke fysiologische niveaus en de flowcytometrieprocedure voor het volgen van de afgifte van synaptische deeltjes door T-cellen. Dit protocol kan worden aangepast om de effecten van individuele eiwitten, complexe ligandmengsels, pathogene virulentiedeterminanten en geneesmiddelen op de effectoroutput van T-cellen te bestuderen, waaronder helper T-cellen, cytotoxische T-lymfocyten, regulerende T-cellen en chimere antigeenreceptor-expresserende T-cellen (CART).

Introduction

De immunologische synaps (IS) is een cruciale moleculaire structuur gevormd op het grensvlak van cellen die betrokken zijn bij fysiek contact dat de gereguleerde uitwisseling van juxtracrine-informatie vergemakkelijkt. Verschillende ES’en zijn beschreven in de literatuur, en een groeiend aantal bewijzen suggereert dat deze moleculaire hubs een geconserveerd kenmerk zijn van cellulaire netwerken. Verschillende immuuncellen, waaronder B-cellen, natural killer-cellen, dendritische cellen, macrofagen en T-cellen, wisselen informatie uit via de assemblage van kortstondige contacten1. Multiomische studies bevorderen het begrip van nieuwe subsets van leukocyten en stromale cellen die pathogene cellulaire netwerken aandrijven en oppervlakte-eiwitten met onbekende functies tot expressie brengen. Als synthetische APC’s maken BSLBs het mogelijk om direct onderzoek te doen naar de functionele rol van individuele eiwitten bij de integratie van activerende signalen, namelijk antigenen en costimulatie/corepressie, door T-cellen en de resulterende afgifte van effectordeeltjes die signaal vier worden genoemd.

Dit artikel beschrijft de protocollen en kritieke technische punten waarmee rekening moet worden gehouden bij het gebruik van BSLBs om de oppervlaktesamenstelling van model-APC’s na te bootsen. De protocollen voor de kwantitatieve meting van immuunreceptoren en andere oppervlakte-eiwitten op APC’s worden gepresenteerd samen met het protocol voor de reconstitutie van synthetische APC’s die deze gemeten hoeveelheden bevatten. Vervolgens worden de stappen die nodig zijn voor het cocultureren van T-cellen en BSLB gepresenteerd, samen met het protocol voor de kwantitatieve meting van trans-synaptische deeltjesoverdracht met behulp van flowcytometrie. Het meest opmerkelijke is dat BSLBs het bestuderen van een plasmamembraan-afgeleide populatie van tSV’s genaamd synaptische ectosomen (SE’s) vergemakkelijken. T-cel antigeenreceptorverrijkte (TCR+) SE’s worden afgestoten als reactie op TCR-triggering2 en efficiënt opgevangen door BSLBs3, wat een uitstekende uitlezing vertegenwoordigt om de agonistische eigenschappen van antigenen en de gemodelleerde membraansamenstelling te beoordelen. CD63+ exosomen en supramoleculaire aanvalsdeeltjes (SMAPs) worden ook vrijgegeven door gestimuleerde T-cellen en opgevangen door BSLBs. Ze kunnen worden gebruikt als extra uitlezingen van activering en de resulterende exocytische en lytische korrelsecretie door T-cellen. De mobilisatie van exocytische blaasjes naar de interagerende pool van de T-cel vergemakkelijkt ook de directionele afgifte van cytokines, zoals IL-2, IFN-γ en IL-10 als reactie op activering4,5,6,7,8. Hoewel T-cel vrijgegeven cytokines ook kunnen worden gedetecteerd op BSLBs, is er momenteel een meer toegewijde studie in ontwikkeling om de kwantitatieve analyse van cytokine-afgifte bij de immunologische synaps te valideren.

Om te onderzoeken hoe specifieke membraansamenstellingen de synaptische output van T-cellen beïnvloeden, moet de fysiologische dichtheid van de doelmembraancomponent worden gedefinieerd. Op flowcytometrie gebaseerde kwantificeringen van celoppervlakeiwitten zijn een essentiële stap in dit protocol en vereisen: 1) het gebruik van antilichamen met bekende aantallen fluorochchromen per antilichaam (F / P), en 2) benchmarkparels die een standaardreferentie bieden voor het interpoleren van fluorochroommoleculen uit gemeten gemiddelde fluorescentie-intensiteiten (MFI’s).

Deze benchmarkstandaarden bestaan uit vijf kralenpopulaties, die elk een toenemend aantal equivalent oplosbare fluorochchromen (MESF’s) bevatten, die het dynamische bereik van willekeurige fluorescentiedetectie overspannen. Deze standaardpopulaties leveren discrete fluorescentiepieken op, waardoor de omzetting van willekeurige fluorescentie-eenheden in MESF’s door eenvoudige lineaire regressie wordt vergemakkelijkt. De resulterende MESF’s worden vervolgens gebruikt naast antilichaam F / P-waarden om het gemiddelde aantal gebonden moleculen per cel (of BSLB in latere stappen) te berekenen. De toepassing van geschatte celoppervlakken op het gemiddelde aantal gedetecteerde moleculen maakt vervolgens de berekening van fysiologische dichtheden als moleculen/μm2 mogelijk. Dit kwantificeringsprotocol kan ook worden aangepast aan de meting van eiwitdichtheden op T-cellen en de biochemische reconstitutie van membraansamenstellingen die de vorming van homotypische T-cel synapsen (d.w.z. T-T-synapsen9) bemiddelen. Indien nodig kan de valentie van antilichaambinding verder worden geschat door recombinante doelen te gebruiken die zijn gelabeld met bekende aantallen fluorochromen per molecuul. Vervolgens kan de antilichaambindende valentie voor dezelfde BSLB-populatie worden berekend door tegelijkertijd het aantal gebonden fluorescerende eiwitten en kwantificeringsantistoffen te vergelijken (met behulp van twee verschillende kwantificeringsfluorocchromen en MESF-normen).

De reconstitutie van APC-membranen vereist de assemblage van ondersteunde lipide bilayers (SLBs) op silicakorrels1. Liposoomvoorraden die verschillende fosfolipidesoorten bevatten, kunnen worden gebruikt om een veelzijdige lipide-dubbellaagsmatrix te vormen, waardoor recombinante eiwitten met verschillende bindingschemie kunnen worden verankerd (de bereiding van liposomen wordt beschreven in 10). Zodra de fysiologische dichtheid (of dichtheden) van het relevante ligand “op cellen” is gedefinieerd, wordt hetzelfde flowcytometrieprotocol aangepast om de concentratie van recombinant eiwit te schatten die nodig is om BSLBs te coaten met de beoogde fysiologische dichtheid. Twee verschillende verankeringssystemen kunnen in combinatie of afzonderlijk worden gebruikt.

Ten eerste is SLB met een laatste 12,5 mol% Ni2+-bevattende fosfolipiden voldoende om ongeveer 10.000 His-tag bindingsplaatsen per vierkante micron10 te leveren en werkt het goed om BSLBs te versieren met de meeste in de handel verkrijgbare eiwitten waarvan de fysiologische dichtheden deze maximale laadcapaciteit niet overschrijden. Het tweede laadsysteem maakt gebruik van biotinebevattende fosfolipiden (als mol%) om gebiotinyleerde anti-CD3e Fab (of HLA/MHC-monomeren) te laden via streptavidinbruggen. De combinatie van deze twee BSLB-decoratiemethoden maakt vervolgens de flexibele afstemming van BSLBs als synthetische APC’s mogelijk. Voor zeer complexe APC-oppervlaktesamenstellingen kan de mol% van fosfolipiden en eiwitten worden verhoogd om zoveel eiwitten te laden als de vraag vereist. Zodra de werkconcentraties van eiwitten en mol% van gebiotinyleerde fosfolipiden zijn gedefinieerd, kunnen BSLBs worden geassembleerd om de synaptische output van T-cellen te ondervragen met multiparametrische flowcytometrie.

Protocol

1. Meting van de eiwitdichtheden van het celoppervlak met kwantitatieve flowcytometrie Bereid 0,22 μm-gefilterde humane flowcytometriebuffer (hFCB) door EDTA (tot een uiteindelijke 2 mM-concentratie) en humaan AB-serum (tot een laatste 10%) toe te voegen aan steriele fosfaatbuffered saline (PBS), pH 7,4 (zie tabel 1). Filtreer de oplossing met behulp van een poriënfiltereenheid van 0,22 μm om serumverontreinigingen te verwijderen en bewaar bij 4 °C. Herstel de cel…

Representative Results

FCM voor absolute eiwitkwantificering op het celoppervlakDe reconstitutie van BSLBs met fysiologische dichtheden van liganden vereist de schatting van de totale eiwitdichtheden op de gemodelleerde celsubset. Om BSLBs te reconstitueren, moet u alle relevante ligand opnemen die naar verwachting een rol zal spelen in de signaalas van belang naast eiwitten die de adhesie en functionele interactie tussen BSLB en cellen ondersteunen, zoals ICAM-1 en kostenimulatorische moleculen, bijvoorbeeld CD40-, CD58- …

Discussion

BSLBs zijn veelzijdige hulpmiddelen voor het bestuderen van de deeltjesoutput van T-cellen gestimuleerd met model APC-membranen. De flexibiliteit van de methode maakt de reconstitutie van complexe en reductionistische membraansamenstellingen mogelijk om de effecten van liganden en hun signalen op de secretie van tSV’s en supramoleculaire aanvalsdeeltjes en hun componenten te bestuderen. We hebben deze technologie getest op verschillende T-cellen, waaronder gepreactiveerde TH, CTL, Tregs en CART15….

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We zijn onze laboratoriumleden en de Kennedy Institute of Rheumatology-gemeenschap dankbaar voor constructieve wetenschappelijke discussies, met name onze flowcytometrie facility manager Jonathan Webber. Dit werk werd gefinancierd door Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z, de ERC Advanced Grant (SYNECT AdG 670930) en de Kennedy Trust for Rheumatology Research (KTRR) (alle drie tot MLD). PFCD werd ondersteund door EMBO Long-Term Fellowship (ALTF 1420-2015, in samenwerking met de Europese Commissie (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) en Marie Sklodowska-Curie Actions) en een Oxford-Bristol Myers Squibb Fellowship.

Materials

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) Avanti Polar Lipids 790404C-25mg 18:1 DGS-NTA(Ni) in chloroform

PIPETMAN L Multichannel P8x200L, 20-200 µL
Gilson FA10011
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850375C-25mg  18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) in chloroform
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 390 ATTO-TEC AD 390-165 DOPE ATTO 390
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 488 ATTO-TEC AD 488-165 DOPE ATTO 488
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 565 ATTO-TEC AD 565-165 DOPE ATTO 565
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt) Avanti Polar Lipids 870273C-25mg 18:1 Biotinyl Cap PE in chloroform
200 µL yellow tips 10 x 96 Tips, Stack Starlab S1111-0206
5 mL polystyrene round-bottom tubes Falcon® 352052
5.00 ± 0.05 µm non-functionalized silica beads Bangs Laboratories Inc. SS05003
96 Well Cell Cultture Plate U-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. Costar® 3799 For FCM staining and co-culture of BSLB and cells.
96 Well Cell Cultture Plate V-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. Costar® 3894 For FCM staining of cells or beads in suspension.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ A20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ A37573 and A20006
Allegra X-12R Centrifuge Beckman Coulter For normal in tube staining of biological samples for FCM
Aluminum Foil Any brand For protecting cells and BSLBs from light
anti-human CD154 (CD40L), clone 24-31 BioLegend 310815 and 310818 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, clone J252D4 BioLegend 356934 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD19 Brilliant Violet 421, clone HIB19 BioLegend 302234 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD2, clone RPA-2.10 BioLegend 300202 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD2, clone TS1/8 BioLegend 309218 Brilliant Violet 421 conjugate.
anti-human CD252 (OX40L), clone 11C3.1 BioLegend Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD28, clone CD28.2 eBioscience 16-0289-85 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD317 (BST2, PDCA-1), clone 26F8 ThermoFisher Scientific, invitrogen 53-3179-42 Alexa Fluor 488 conjugate, we found this clone to be cleaner than clone RS38E.
anti-human CD38, clone HB-7 BioLegend 356624 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD38, clone HIT2 BioLegend 303514 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD39, clone A1 BioLegend Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD4 Brilliant Violet 650, clone OKT4 BioLegend 317436 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD4, clone A161A1 BioLegend 357414 and 357421 PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD4, clone OKT4 BioLegend 317414 and 317422 PE/Cy7 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD40, clone 5C3 BioLegend 334304 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD40, clone G28.5 BioLegend Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD45, clone HI30 BioLegend 304056 and 368516 Alexa Fluor 647 and APC/Cy7 conjugates
anti-human CD47, clone CC2C6 BioLegend 323118 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD54 (ICAM-1), clone HCD54 BioLegend 322702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD63 (LAMP-3), clone H5C6 BioLegend 353020 and 353015 PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD73, clone AD2 BioLegend 344002 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD80, clone 2D10 BioLegend 305216 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD81, clone 5A6 BioLegend 349512 and 349502 PE/Cy7 conjugate and labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), respectively.
anti-human CD82, clone ASL-24 BioLegend 342108 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD86, clone IT2.2 BioLegend 305416 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD8a, clone HIT8a BioLegend 300920 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD8a, clone SK1 BioLegend 344724 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human HLA-A/B/C/E, clone w6/32 BioLegend 311414 and 311402 Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human HLA-DR, clone L243 BioLegend 307656 and 307622 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human ICAM-1, clone HCD54 BioLegend 322702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human ICOS, clone C398.4A BioLegend 313516 Armenian Hamster IgG
anti-human ICOSL, clone MIH12 BioLegend 329611 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human ICOSL, clone MIH12 eBioscience 16-5889-82 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human LFA-1, clone TS1/22 BioLegend Produced in house Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35) BioLegend 350018 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-1 , clone EH12.2H7 BioLegend 135230 and 329902 Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L1, clone 29E.2A3 BioLegend 329702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L2, clone 24F.10C12 BioLegend 329611 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-L2, clone MIH18 BioLegend 345502 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human TCRab, clone IP26 BioLegend 306712 and 306714 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
antti-human CD156c (ADAM10), clone SHM14 BioLegend 352702
antti-human CD317 (BST2, Tetherin), clone RS38E BioLegend 348404 Alexa Fluor 647 conjugate
Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 Isotype control, clone HTK888 BioLegend 400902 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
BD Cytometer Setup and Tracking beads Becton Dickinson & Company (BD) 641319 Performance track of instruments before quantitative FCM
BD FACSDiva Becton Dickinson & Company (BD) 23-14523-00 Acquisition software
Bovine Seum Albumin Merck, Sigma-Aldrich A3294
CaCl2, Calcium chloride Merck, Sigma-Aldrich C5670 anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0%
Casein from bovine milk, suitable for substrate for protein kinase (after dephosphorylation), purified powder Merck, Sigma-Aldrich C5890
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 ThermoFisher Scientific, Gibco 11132D
DynaMag-2 ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ 12321D For the removal of Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 2 mL
DynaMag™-15 ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ 12301D For the removal of Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 15 mL
Fetal Bovine Serum Qualified, One Shot ThermoFisher Scientific, Gibco A3160801 Needs heat inactivation for 30 min at 56 oC
Ficoll-Paque PLUS Cytiva, GE Healthcare GE17-1440-02 Sterile solution of polysaccharide and sodium diatrizoate for lymphocyte isolation
Fixable Viability Dye eFluor 780 eBiosciences 65-0865-14 For the exclusion of dead cells during analyses
FlowJo Becton Dickinson & Company (BD) Version 10.7.1 Analysis software
Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker Keison Products MPS-1 For the mixing of either cells during stainings or BSLBs during staning or protein loading (as an alternative to orbital agitation)
HEPES Buffer Solution (1 M) ThermoFisher Scientific, Gibco 15630-056
HEPES, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid. Merck, Sigma-Aldrich H4034 For preparation of HBS/HAS or HBS/BSA buffer. BioPerformance Certified, ≥99.5% (titration), suitable for cell culture
HERACell 150i CO2 incubator, 150 L, Electropolished Stainless Steel ThermoFisher Scientific 51026282 For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Hula Mixer® Sample Mixer ThermoFisher Scientific, Life Technologies 15920D Vertical, variable-angle laboratory mixer used for the mixing of BSLBs and lipid master mix, blocking solutions, protein master mix and small scale antibody stainings.
Human Serum Albumin, 30% aqueous solution Merck, Sigma-Aldrich 12667-M
Human TruStain FcX Fc Receptor Blocking Solution BioLegend 422302 Fc Receptor Blocking Solution for blocking of Fc Receptors from biologically relevant samples
Innovatis CASY cell counter and analyzer TT Biovendis Products GmbH For the counting of cells and the determination of cell size and volume based on the exclusion of electric current.
KCl, Potassium chloride Merck, Sigma-Aldrich P5405 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
L-Glutamine 200 mM (100x) ThermoFisher Scientific, Gibco 25030-024
MgCl2, Magessium chloride Merck, Sigma-Aldrich M2393 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture
Microtube Insert for 24 x 1.5/2.0 mL tubes Keison Products P-2-24 Microtube insert for Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker
Mini Incubator Labnet International  I5110A-230V For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2
Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids ThermoFisher Scientific, Gibco 11140-035
Mouse IgG polyclonal antibody control Merck, Sigma-Aldrich PP54 Used as positive control for the measurement of antibodies bound to mouse IgG capture bead standards
Mouse IgG1, k Isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400129, 400112, 400130, 400144, 400128 and 400170 Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 and Brilliant Violet 785  conjugates, respectively.
Mouse IgG1, k Isotype, clone X40 Becton Dickinson & Company (BD), Horizon 562438 Brilliant Violet 421 conjugate.
Mouse IgG1, κ Isotype control, clone P3.6.2.8.1 eBioscience 14-4714-82 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Mouse IgG2a, k Isotype, clone MOPC-173 BioLegend 400240 Alexa Fluor 647 conjugate
Mouse IgG2b, k Isotype, clone MPC-11 BioLegend 400330 and 400355 Alexa Fluor 647 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively
Multiwell 6 well Tissue culture treated with vacuum gas plasma Falcon 353046 For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Na2HPO4, Disodium Phosphate Merck, Sigma-Aldrich S7907
NaCl, Sodium chloride Merck, Sigma-Aldrich S5886 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99%
NiSO4, Nickel(II) sulfate Merck, Sigma-Aldrich 656895 For saturating NTA sites; added during the blocking process
Penicillin Streptomycin [+]10,000 units Penicillin; [+] 10,000 µg/mL Streptomycin ThermoFisher Scientific, Gibco 15140-122
Phosphate Buffered Saline pH 7.4, sterile ThermoFisher Scientific, Gibco 10010 No Ca2+ or Mg2+ added
Polyethersulfone (PES) Filter unit Thermo Scientific Nalgene  UY-06730-43 Hydrophilic PES membrane with low protein binding facilitates the filtering of solutions with high protein content
PURESHIELD argon ISO 14175-I1-Ar BOC Ltd. 11-Y For the protection of lipid stocks stored at +4 ºC.
Purified Streptavidin BioLegend 280302
Quantum Alexa Fluor 488 MESF beads Bangs Laboratories Inc. 488 Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 488 molecules bound to cells and/or BSLB
Quantum Alexa Fluor 647 MESF beads Bangs Laboratories Inc. 647 Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 647 molecules bound to cells and/or BSLB
Rat anti-mouse IgG Kappa Light Chain, clone OX-20 ThermoFisher Scientific, invitrogen SA1-25258 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Recombinant human IL-2 Peprotech 200-02-1MG
RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-Glutamine ThermoFisher Scientific, Gibco 31870-025
Rosette Human B Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15064 Isolation of B cells for measuring densities of proteins in purified cell populations
Rosette Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15022C.1
Rosette Human CD4+CD127low T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15361 Pre-enrichment of CD4+ CD127Low T cells for the downstream isolation of Tregs by FACS.
Rosette Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15063
RPMI Medium 1640 (1x); [-] Phenol Red ThermoFisher Scientific, Gibco 11835-063 For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2. Phenol red-free media reduces the autofluorescence of cells in flow cytometry and microscopy based measurements.
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific, Gibco 11360-070
Sprout mini centrifuge FisherScientific, Heathrow Scientific LLC 120301 Benchtop microcentrifuge used to wash silica beads and BSLB in 1.5 mL Eppendorf tubes.
Sterile cappeed 5 mL polystyrene round-bottom tubes Falcon 352058
UltraComp eBeads Compensation Beads ThermoFisher Scientific, invitrogen 01-2222-42
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ 89882

Referanslar

  1. Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling. FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).
  2. Choudhuri, K., et al. Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse. Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).
  3. Saliba, D. G., et al. Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells. elife. 8, 47528 (2019).
  4. Barcia, C., et al. In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells. Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).
  5. Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion. Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).
  6. Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).
  7. Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions. Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).
  8. Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells. Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).
  9. Gerard, A., et al. Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells. Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).
  10. Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Current Protocols in Immunology. , (2007).
  11. Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2021)
  12. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).
  13. Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers. Frontiers in Physiology. 11, 613367 (2020).
  14. Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design. Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).
  15. Céspedes, P. F., et al. Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses. bioRxiv. , (2021).
  16. Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).
  17. Roederer, M. Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not. Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).
  18. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  19. Balint, S., et al. Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells. Science. 368 (6493), 897-901 (2020).
  20. Cespedes, P. F., et al. Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Céspedes, P. F., Dustin, M. L. Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses. J. Vis. Exp. (182), e63130, doi:10.3791/63130 (2022).

View Video