Özet

تحضير الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة بالخرز لدراسة إنتاج الجسيمات من المشابك المناعية للخلايا التائية

Published: April 01, 2022
doi:

Özet

نقدم هنا بروتوكول إعادة التشكيل التدريجي للخلايا الاصطناعية التي تقدم المستضدات باستخدام الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة بالخرز واستخدامها لاستجواب الإخراج المشبكي من الخلايا التائية المنشطة.

Abstract

تقدم الخلايا التي تقدم المستضدات (APCs) ثلاث إشارات تنشيط للخلايا التائية المشاركة في الاتصال الجسدي: 1) المستضد ، 2) التحفيز / التكبت المشترك ، و 3) السيتوكينات القابلة للذوبان. تطلق الخلايا التائية نوعين من الجسيمات المستجيبة استجابة للتنشيط: الحويصلات عبر المشبكية (tSVs) وجزيئات الهجوم فوق الجزيئي ، التي تنقل الرسل بين الخلايا والسمية الخلوية الوسيطة ، على التوالي. يتم استيعاب هذه الكيانات بسرعة من قبل APCs المشاركة في اتصال جسدي مع الخلايا التائية ، مما يجعل توصيفها شاقا. تقدم هذه الورقة بروتوكول تصنيع واستخدام الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة بالخرز (BSLBs) كمحاكاة للخلايا التي تقدم المستضدات (APC) لالتقاط وتحليل هذه الجسيمات عبر المشبكي. كما تم وصف بروتوكولات القياسات المطلقة لكثافات البروتين على أسطح الخلايا ، وإعادة تكوين BSLBs بهذه المستويات الفسيولوجية ، وإجراء قياس التدفق الخلوي لتتبع إطلاق الجسيمات المشبكية بواسطة الخلايا التائية. يمكن تكييف هذا البروتوكول لدراسة آثار البروتينات الفردية ، ومخاليط الليغاند المعقدة ، ومحددات الضراوة المسببة للأمراض ، والأدوية على مخرجات المستجيب للخلايا التائية ، بما في ذلك الخلايا التائية المساعدة ، والخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا ، والخلايا التائية التنظيمية ، والخلايا التائية المعبرة عن مستقبلات المستضدات الخيمرية (CART).

Introduction

المشبك المناعي (IS) هو بنية جزيئية محورية تشكلت في واجهة الخلايا المشاركة في الاتصال المادي الذي يسهل التبادل المنظم للمعلومات juxtracrine. تم وصف ISs مختلفة في الأدبيات ، وتشير مجموعة متزايدة من الأدلة إلى أن هذه المحاور الجزيئية هي سمة محفوظة للشبكات الخلوية. تتبادل الخلايا المناعية المختلفة، بما في ذلك الخلايا البائية والخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا المتغصنة والبلاعم والخلايا التائية، المعلومات عبر تجميع جهات الاتصال قصيرة العمر1. تعمل الدراسات متعددة الأطوار على تطوير فهم مجموعات فرعية جديدة من الكريات البيض والخلايا اللحمية التي تقود الشبكات الخلوية المسببة للأمراض وتعبر عن البروتينات السطحية ذات الوظائف غير المعروفة. كمدادات APC اصطناعية ، تسمح BSLBs بالتحقيق المباشر في الدور الوظيفي للبروتينات الفردية في دمج إشارات التنشيط ، أي المستضدات والتحفيز / التكبت المشترك ، بواسطة الخلايا التائية والإطلاق الناتج عن جزيئات المستجيب المشار إليها باسم الإشارة الرابعة.

تصف هذه الورقة البروتوكولات والنقاط التقنية الحرجة التي يجب مراعاتها أثناء استخدام BSLBs لمحاكاة التركيب السطحي ل APCs النموذجية. يتم تقديم بروتوكولات القياس الكمي للمستقبلات المناعية والبروتينات السطحية الأخرى على APCs جنبا إلى جنب مع بروتوكول إعادة تشكيل APCs الاصطناعية التي تحتوي على هذه الكميات المقاسة. بعد ذلك ، يتم تقديم الخطوات المطلوبة لزراعة الخلايا التائية و BSLB جنبا إلى جنب مع بروتوكول القياس الكمي لنقل الجسيمات عبر المشبكية باستخدام قياس التدفق الخلوي. والأكثر لفتا للنظر هو أن BSLBs تسهل دراسة مجموعة مشتقة من غشاء البلازما من tSVs تسمى الإكستومات المشبكية (SEs). يتم التخلص من SEs المخصب بمستقبلات مستضدات الخلايا التائية (TCR+) استجابة لمحفزات TCR2 ويتم التقاطها بكفاءة بواسطة BSLBs3 ، مما يمثل قراءة ممتازة لتقييم الخصائص الناهضة للمستضدات وتكوين الغشاء النموذجي. يتم إطلاق الإكسوسومات CD63+ وجزيئات الهجوم فوق الجزيئي (SMAPs) أيضا بواسطة الخلايا التائية المحفزة والتقاطها بواسطة BSLBs. يمكن استخدامها كقراءات إضافية للتنشيط وإفراز الحبيبات الخارجية والليزتيكية الناتجة بواسطة الخلايا التائية. كما أن تعبئة الحويصلات الخارجية إلى القطب المتفاعل للخلية التائية تسهل أيضا الإطلاق الاتجاهي للسيتوكينات ، مثل IL-2 و IFN-γ و IL-10 استجابة للتنشيط 4،5،6،7،8. على الرغم من أنه يمكن أيضا اكتشاف السيتوكينات التي تطلق الخلايا التائية على BSLBs ، إلا أنه يجري حاليا تطوير دراسة أكثر تكريسا للتحقق من صحة التحليل الكمي لإطلاق السيتوكين في المشبك المناعي.

لاستجواب كيفية تأثير تركيبات غشائية محددة على الناتج المشبكي للخلايا التائية يتطلب تحديد الكثافة الفسيولوجية لمكون الغشاء المستهدف. تعد القياسات الكمية القائمة على قياس التدفق الخلوي لبروتينات سطح الخلية خطوة أساسية في هذا البروتوكول وتتطلب: 1) استخدام الأجسام المضادة ذات الأعداد المعروفة من الفلوروكرومات لكل جسم مضاد (F / P) ، و 2) الخرز القياسي الذي يوفر مرجعا قياسيا لاستيفاء جزيئات الفلوروكروم من متوسط كثافة التألق المقاسة (MFIs).

تتكون هذه المعايير المرجعية من خمس مجموعات من الخرز ، يحتوي كل منها على عدد متزايد من الفلوروكرومات القابلة للذوبان المكافئة (MESFs) ، والتي تمتد عبر النطاق الديناميكي للكشف الاعتباطي التعسفي. تنتج هذه المجموعات السكانية القياسية قمم فلورية منفصلة ، مما يسهل تحويل وحدات التألق التعسفية إلى MESFs عن طريق الانحدار الخطي البسيط. ثم يتم استخدام MESFs الناتجة جنبا إلى جنب مع قيم الأجسام المضادة F / P لحساب متوسط عدد الجزيئات المرتبطة لكل خلية (أو BSLB في خطوات لاحقة). ثم يتيح تطبيق مساحات سطح الخلية المقدرة على متوسط عدد الجزيئات المكتشفة حساب الكثافات الفسيولوجية كجزيئات/ميكرومتر2. يمكن أيضا تكييف بروتوكول القياس الكمي هذا لقياس كثافات البروتين على الخلايا التائية وإعادة التركيب الكيميائي الحيوي لتركيبات الغشاء التي تتوسط في تكوين نقاط الاشتباك العصبي للخلايا التائية المتجانسة (أي نقاط الاشتباك العصبي T-T9). إذا لزم الأمر ، يمكن زيادة تقدير تكافؤ ارتباط الأجسام المضادة باستخدام أهداف مؤتلفة تحمل أعدادا معروفة من الفلوروكروم لكل جزيء. بعد ذلك ، يمكن حساب التكافؤ المرتبط بالأجسام المضادة لنفس مجموعة BSLB عن طريق مقارنة عدد البروتينات الفلورية المرتبطة والأجسام المضادة الكمي في وقت واحد (باستخدام اثنين مختلفين من الفلوروكرومات الكمية ومعايير MESF).

تتطلب إعادة تكوين أغشية APC تجميع الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة (SLBs) على حبات السيليكا 1. يمكن تسخير مخزونات الجسيمات الشحمية التي تحتوي على أنواع مختلفة من الدهون الفوسفاتية لتشكيل مصفوفة متعددة الاستخدامات ثنائية الطبقة من الدهون ، مما يتيح تثبيت البروتينات المؤتلفة مع كيمياء ربط مختلفة (يتم تفصيل إعداد الجسيمات الشحمية في 10). بمجرد تحديد الكثافة الفسيولوجية (أو الكثافات) للرباط ذي الصلة “على الخلايا” ، يتم تكييف نفس بروتوكول قياس التدفق الخلوي لتقدير تركيز البروتين المؤتلف اللازم لطلاء BSLBs بالكثافة الفسيولوجية المستهدفة. يمكن استخدام نظامي تثبيت مختلفين إما مجتمعين أو بشكل منفصل.

أولا ، SLB الذي يحتوي على 12.5 مول ٪ من الدهون الفوسفاتية المحتوية على Ni2 + يكفي لتوفير ما يقرب من 10000 موقع ربط علامته لكل ميكرون مربع 10 ويعمل بشكل جيد لتزيين BSLBs بمعظم البروتينات المتاحة تجاريا والتي لا تتجاوز كثافاتها الفسيولوجية قدرة التحميل القصوى هذه. يسخر نظام التحميل الثاني الدهون الفوسفاتية المحتوية على البيوتين (مثل مول٪) لتحميل البيوتينيل المضاد ل CD3e Fab (أو مونومرات HLA / MHC) عبر جسور الستربتافيدين. ثم يتيح الجمع بين هاتين الطريقتين للزينة BSLB الخياطة المرنة ل BSLBs كمدادات APCs اصطناعية. بالنسبة للتركيبات السطحية APC المعقدة للغاية ، يمكن زيادة نسبة المول٪ من الدهون الفوسفاتية والبروتينات لتحميل أكبر عدد ممكن من البروتينات التي يتطلبها السؤال المطروح. بمجرد تحديد تركيزات العمل من البروتينات و mol٪ من الدهون الفوسفاتية البيوتينيل ، يمكن تجميع BSLBs لاستجواب الإخراج المشبكي للخلايا التائية باستخدام قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات.

Protocol

1. قياس كثافة البروتين على سطح الخلية مع قياس التدفق الخلوي الكمي قم بإعداد المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي البشري المصفى بسعة 0.22 ميكرومتر (hFCB) عن طريق إضافة EDTA (إلى تركيز نهائي 2 ملليمتر) ومصل AB البشري (إلى 10٪ نهائي) إلى محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) ، الرقم الهيدروجيني 7…

Representative Results

FCM لتحديد كمية البروتين المطلق على سطح الخليةتتطلب إعادة تكوين BSLBs التي تقدم كثافات فسيولوجية للروابط تقدير كثافة البروتين الكلية على المجموعة الفرعية للخلايا النموذجية. لإعادة تشكيل BSLBs ، قم بتضمين أي روابط ذات صلة من المتوقع أن تلعب دورا في محور الإشارة ذي الأهمية إلى جانب ال…

Discussion

BSLBs هي أدوات متعددة الاستخدامات لدراسة إخراج الجسيمات من الخلايا التائية التي يتم تحفيزها باستخدام أغشية APC النموذجية. تسمح مرونة الطريقة بإعادة تكوين تركيبات الأغشية المعقدة والاختزالية لدراسة آثار الأربطة وإشاراتها على إفراز tSVs وجزيئات الهجوم فوق الجزيئي ومكوناتها. لقد اختبرنا هذه ال…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نحن ممتنون لأعضاء مختبرنا ومجتمع معهد كينيدي لأمراض الروماتيزم على المناقشات العلمية البناءة ، وخاصة مدير مرفق قياس التدفق الخلوي جوناثان ويبر. تم تمويل هذا العمل من قبل زمالة Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z ، ومنحة ERC المتقدمة (SYNECT AdG 670930) ، وصندوق كينيدي لأبحاث الروماتيزم (KTRR) (الثلاثة إلى MLD). تم دعم PFCD من قبل زمالة EMBO طويلة الأجل (ALTF 1420-2015 ، بالتعاون مع المفوضية الأوروبية (LTFCOFUND2013 ، GA-2013-609409) وماري Sklodowska-Curie Actions) وزمالة أكسفورد-بريستول مايرز سكويب.

Materials

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) Avanti Polar Lipids 790404C-25mg 18:1 DGS-NTA(Ni) in chloroform

PIPETMAN L Multichannel P8x200L, 20-200 µL
Gilson FA10011
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850375C-25mg  18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) in chloroform
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 390 ATTO-TEC AD 390-165 DOPE ATTO 390
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 488 ATTO-TEC AD 488-165 DOPE ATTO 488
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 565 ATTO-TEC AD 565-165 DOPE ATTO 565
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt) Avanti Polar Lipids 870273C-25mg 18:1 Biotinyl Cap PE in chloroform
200 µL yellow tips 10 x 96 Tips, Stack Starlab S1111-0206
5 mL polystyrene round-bottom tubes Falcon® 352052
5.00 ± 0.05 µm non-functionalized silica beads Bangs Laboratories Inc. SS05003
96 Well Cell Cultture Plate U-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. Costar® 3799 For FCM staining and co-culture of BSLB and cells.
96 Well Cell Cultture Plate V-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. Costar® 3894 For FCM staining of cells or beads in suspension.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ A20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ A37573 and A20006
Allegra X-12R Centrifuge Beckman Coulter For normal in tube staining of biological samples for FCM
Aluminum Foil Any brand For protecting cells and BSLBs from light
anti-human CD154 (CD40L), clone 24-31 BioLegend 310815 and 310818 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, clone J252D4 BioLegend 356934 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD19 Brilliant Violet 421, clone HIB19 BioLegend 302234 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD2, clone RPA-2.10 BioLegend 300202 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD2, clone TS1/8 BioLegend 309218 Brilliant Violet 421 conjugate.
anti-human CD252 (OX40L), clone 11C3.1 BioLegend Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD28, clone CD28.2 eBioscience 16-0289-85 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD317 (BST2, PDCA-1), clone 26F8 ThermoFisher Scientific, invitrogen 53-3179-42 Alexa Fluor 488 conjugate, we found this clone to be cleaner than clone RS38E.
anti-human CD38, clone HB-7 BioLegend 356624 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD38, clone HIT2 BioLegend 303514 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD39, clone A1 BioLegend Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD4 Brilliant Violet 650, clone OKT4 BioLegend 317436 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD4, clone A161A1 BioLegend 357414 and 357421 PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD4, clone OKT4 BioLegend 317414 and 317422 PE/Cy7 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD40, clone 5C3 BioLegend 334304 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD40, clone G28.5 BioLegend Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD45, clone HI30 BioLegend 304056 and 368516 Alexa Fluor 647 and APC/Cy7 conjugates
anti-human CD47, clone CC2C6 BioLegend 323118 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD54 (ICAM-1), clone HCD54 BioLegend 322702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD63 (LAMP-3), clone H5C6 BioLegend 353020 and 353015 PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD73, clone AD2 BioLegend 344002 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD80, clone 2D10 BioLegend 305216 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD81, clone 5A6 BioLegend 349512 and 349502 PE/Cy7 conjugate and labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), respectively.
anti-human CD82, clone ASL-24 BioLegend 342108 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD86, clone IT2.2 BioLegend 305416 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD8a, clone HIT8a BioLegend 300920 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD8a, clone SK1 BioLegend 344724 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human HLA-A/B/C/E, clone w6/32 BioLegend 311414 and 311402 Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human HLA-DR, clone L243 BioLegend 307656 and 307622 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human ICAM-1, clone HCD54 BioLegend 322702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human ICOS, clone C398.4A BioLegend 313516 Armenian Hamster IgG
anti-human ICOSL, clone MIH12 BioLegend 329611 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human ICOSL, clone MIH12 eBioscience 16-5889-82 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human LFA-1, clone TS1/22 BioLegend Produced in house Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35) BioLegend 350018 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-1 , clone EH12.2H7 BioLegend 135230 and 329902 Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L1, clone 29E.2A3 BioLegend 329702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L2, clone 24F.10C12 BioLegend 329611 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-L2, clone MIH18 BioLegend 345502 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human TCRab, clone IP26 BioLegend 306712 and 306714 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
antti-human CD156c (ADAM10), clone SHM14 BioLegend 352702
antti-human CD317 (BST2, Tetherin), clone RS38E BioLegend 348404 Alexa Fluor 647 conjugate
Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 Isotype control, clone HTK888 BioLegend 400902 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
BD Cytometer Setup and Tracking beads Becton Dickinson & Company (BD) 641319 Performance track of instruments before quantitative FCM
BD FACSDiva Becton Dickinson & Company (BD) 23-14523-00 Acquisition software
Bovine Seum Albumin Merck, Sigma-Aldrich A3294
CaCl2, Calcium chloride Merck, Sigma-Aldrich C5670 anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0%
Casein from bovine milk, suitable for substrate for protein kinase (after dephosphorylation), purified powder Merck, Sigma-Aldrich C5890
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 ThermoFisher Scientific, Gibco 11132D
DynaMag-2 ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ 12321D For the removal of Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 2 mL
DynaMag™-15 ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ 12301D For the removal of Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 15 mL
Fetal Bovine Serum Qualified, One Shot ThermoFisher Scientific, Gibco A3160801 Needs heat inactivation for 30 min at 56 oC
Ficoll-Paque PLUS Cytiva, GE Healthcare GE17-1440-02 Sterile solution of polysaccharide and sodium diatrizoate for lymphocyte isolation
Fixable Viability Dye eFluor 780 eBiosciences 65-0865-14 For the exclusion of dead cells during analyses
FlowJo Becton Dickinson & Company (BD) Version 10.7.1 Analysis software
Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker Keison Products MPS-1 For the mixing of either cells during stainings or BSLBs during staning or protein loading (as an alternative to orbital agitation)
HEPES Buffer Solution (1 M) ThermoFisher Scientific, Gibco 15630-056
HEPES, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid. Merck, Sigma-Aldrich H4034 For preparation of HBS/HAS or HBS/BSA buffer. BioPerformance Certified, ≥99.5% (titration), suitable for cell culture
HERACell 150i CO2 incubator, 150 L, Electropolished Stainless Steel ThermoFisher Scientific 51026282 For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Hula Mixer® Sample Mixer ThermoFisher Scientific, Life Technologies 15920D Vertical, variable-angle laboratory mixer used for the mixing of BSLBs and lipid master mix, blocking solutions, protein master mix and small scale antibody stainings.
Human Serum Albumin, 30% aqueous solution Merck, Sigma-Aldrich 12667-M
Human TruStain FcX Fc Receptor Blocking Solution BioLegend 422302 Fc Receptor Blocking Solution for blocking of Fc Receptors from biologically relevant samples
Innovatis CASY cell counter and analyzer TT Biovendis Products GmbH For the counting of cells and the determination of cell size and volume based on the exclusion of electric current.
KCl, Potassium chloride Merck, Sigma-Aldrich P5405 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
L-Glutamine 200 mM (100x) ThermoFisher Scientific, Gibco 25030-024
MgCl2, Magessium chloride Merck, Sigma-Aldrich M2393 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture
Microtube Insert for 24 x 1.5/2.0 mL tubes Keison Products P-2-24 Microtube insert for Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker
Mini Incubator Labnet International  I5110A-230V For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2
Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids ThermoFisher Scientific, Gibco 11140-035
Mouse IgG polyclonal antibody control Merck, Sigma-Aldrich PP54 Used as positive control for the measurement of antibodies bound to mouse IgG capture bead standards
Mouse IgG1, k Isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400129, 400112, 400130, 400144, 400128 and 400170 Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 and Brilliant Violet 785  conjugates, respectively.
Mouse IgG1, k Isotype, clone X40 Becton Dickinson & Company (BD), Horizon 562438 Brilliant Violet 421 conjugate.
Mouse IgG1, κ Isotype control, clone P3.6.2.8.1 eBioscience 14-4714-82 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Mouse IgG2a, k Isotype, clone MOPC-173 BioLegend 400240 Alexa Fluor 647 conjugate
Mouse IgG2b, k Isotype, clone MPC-11 BioLegend 400330 and 400355 Alexa Fluor 647 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively
Multiwell 6 well Tissue culture treated with vacuum gas plasma Falcon 353046 For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Na2HPO4, Disodium Phosphate Merck, Sigma-Aldrich S7907
NaCl, Sodium chloride Merck, Sigma-Aldrich S5886 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99%
NiSO4, Nickel(II) sulfate Merck, Sigma-Aldrich 656895 For saturating NTA sites; added during the blocking process
Penicillin Streptomycin [+]10,000 units Penicillin; [+] 10,000 µg/mL Streptomycin ThermoFisher Scientific, Gibco 15140-122
Phosphate Buffered Saline pH 7.4, sterile ThermoFisher Scientific, Gibco 10010 No Ca2+ or Mg2+ added
Polyethersulfone (PES) Filter unit Thermo Scientific Nalgene  UY-06730-43 Hydrophilic PES membrane with low protein binding facilitates the filtering of solutions with high protein content
PURESHIELD argon ISO 14175-I1-Ar BOC Ltd. 11-Y For the protection of lipid stocks stored at +4 ºC.
Purified Streptavidin BioLegend 280302
Quantum Alexa Fluor 488 MESF beads Bangs Laboratories Inc. 488 Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 488 molecules bound to cells and/or BSLB
Quantum Alexa Fluor 647 MESF beads Bangs Laboratories Inc. 647 Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 647 molecules bound to cells and/or BSLB
Rat anti-mouse IgG Kappa Light Chain, clone OX-20 ThermoFisher Scientific, invitrogen SA1-25258 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Recombinant human IL-2 Peprotech 200-02-1MG
RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-Glutamine ThermoFisher Scientific, Gibco 31870-025
Rosette Human B Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15064 Isolation of B cells for measuring densities of proteins in purified cell populations
Rosette Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15022C.1
Rosette Human CD4+CD127low T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15361 Pre-enrichment of CD4+ CD127Low T cells for the downstream isolation of Tregs by FACS.
Rosette Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15063
RPMI Medium 1640 (1x); [-] Phenol Red ThermoFisher Scientific, Gibco 11835-063 For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2. Phenol red-free media reduces the autofluorescence of cells in flow cytometry and microscopy based measurements.
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific, Gibco 11360-070
Sprout mini centrifuge FisherScientific, Heathrow Scientific LLC 120301 Benchtop microcentrifuge used to wash silica beads and BSLB in 1.5 mL Eppendorf tubes.
Sterile cappeed 5 mL polystyrene round-bottom tubes Falcon 352058
UltraComp eBeads Compensation Beads ThermoFisher Scientific, invitrogen 01-2222-42
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ 89882

Referanslar

  1. Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling. FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).
  2. Choudhuri, K., et al. Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse. Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).
  3. Saliba, D. G., et al. Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells. elife. 8, 47528 (2019).
  4. Barcia, C., et al. In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells. Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).
  5. Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion. Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).
  6. Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).
  7. Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions. Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).
  8. Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells. Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).
  9. Gerard, A., et al. Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells. Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).
  10. Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Current Protocols in Immunology. , (2007).
  11. Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2021)
  12. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).
  13. Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers. Frontiers in Physiology. 11, 613367 (2020).
  14. Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design. Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).
  15. Céspedes, P. F., et al. Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses. bioRxiv. , (2021).
  16. Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).
  17. Roederer, M. Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not. Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).
  18. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  19. Balint, S., et al. Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells. Science. 368 (6493), 897-901 (2020).
  20. Cespedes, P. F., et al. Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Céspedes, P. F., Dustin, M. L. Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses. J. Vis. Exp. (182), e63130, doi:10.3791/63130 (2022).

View Video