نقدم هنا بروتوكول إعادة التشكيل التدريجي للخلايا الاصطناعية التي تقدم المستضدات باستخدام الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة بالخرز واستخدامها لاستجواب الإخراج المشبكي من الخلايا التائية المنشطة.
تقدم الخلايا التي تقدم المستضدات (APCs) ثلاث إشارات تنشيط للخلايا التائية المشاركة في الاتصال الجسدي: 1) المستضد ، 2) التحفيز / التكبت المشترك ، و 3) السيتوكينات القابلة للذوبان. تطلق الخلايا التائية نوعين من الجسيمات المستجيبة استجابة للتنشيط: الحويصلات عبر المشبكية (tSVs) وجزيئات الهجوم فوق الجزيئي ، التي تنقل الرسل بين الخلايا والسمية الخلوية الوسيطة ، على التوالي. يتم استيعاب هذه الكيانات بسرعة من قبل APCs المشاركة في اتصال جسدي مع الخلايا التائية ، مما يجعل توصيفها شاقا. تقدم هذه الورقة بروتوكول تصنيع واستخدام الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة بالخرز (BSLBs) كمحاكاة للخلايا التي تقدم المستضدات (APC) لالتقاط وتحليل هذه الجسيمات عبر المشبكي. كما تم وصف بروتوكولات القياسات المطلقة لكثافات البروتين على أسطح الخلايا ، وإعادة تكوين BSLBs بهذه المستويات الفسيولوجية ، وإجراء قياس التدفق الخلوي لتتبع إطلاق الجسيمات المشبكية بواسطة الخلايا التائية. يمكن تكييف هذا البروتوكول لدراسة آثار البروتينات الفردية ، ومخاليط الليغاند المعقدة ، ومحددات الضراوة المسببة للأمراض ، والأدوية على مخرجات المستجيب للخلايا التائية ، بما في ذلك الخلايا التائية المساعدة ، والخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا ، والخلايا التائية التنظيمية ، والخلايا التائية المعبرة عن مستقبلات المستضدات الخيمرية (CART).
المشبك المناعي (IS) هو بنية جزيئية محورية تشكلت في واجهة الخلايا المشاركة في الاتصال المادي الذي يسهل التبادل المنظم للمعلومات juxtracrine. تم وصف ISs مختلفة في الأدبيات ، وتشير مجموعة متزايدة من الأدلة إلى أن هذه المحاور الجزيئية هي سمة محفوظة للشبكات الخلوية. تتبادل الخلايا المناعية المختلفة، بما في ذلك الخلايا البائية والخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا المتغصنة والبلاعم والخلايا التائية، المعلومات عبر تجميع جهات الاتصال قصيرة العمر1. تعمل الدراسات متعددة الأطوار على تطوير فهم مجموعات فرعية جديدة من الكريات البيض والخلايا اللحمية التي تقود الشبكات الخلوية المسببة للأمراض وتعبر عن البروتينات السطحية ذات الوظائف غير المعروفة. كمدادات APC اصطناعية ، تسمح BSLBs بالتحقيق المباشر في الدور الوظيفي للبروتينات الفردية في دمج إشارات التنشيط ، أي المستضدات والتحفيز / التكبت المشترك ، بواسطة الخلايا التائية والإطلاق الناتج عن جزيئات المستجيب المشار إليها باسم الإشارة الرابعة.
تصف هذه الورقة البروتوكولات والنقاط التقنية الحرجة التي يجب مراعاتها أثناء استخدام BSLBs لمحاكاة التركيب السطحي ل APCs النموذجية. يتم تقديم بروتوكولات القياس الكمي للمستقبلات المناعية والبروتينات السطحية الأخرى على APCs جنبا إلى جنب مع بروتوكول إعادة تشكيل APCs الاصطناعية التي تحتوي على هذه الكميات المقاسة. بعد ذلك ، يتم تقديم الخطوات المطلوبة لزراعة الخلايا التائية و BSLB جنبا إلى جنب مع بروتوكول القياس الكمي لنقل الجسيمات عبر المشبكية باستخدام قياس التدفق الخلوي. والأكثر لفتا للنظر هو أن BSLBs تسهل دراسة مجموعة مشتقة من غشاء البلازما من tSVs تسمى الإكستومات المشبكية (SEs). يتم التخلص من SEs المخصب بمستقبلات مستضدات الخلايا التائية (TCR+) استجابة لمحفزات TCR2 ويتم التقاطها بكفاءة بواسطة BSLBs3 ، مما يمثل قراءة ممتازة لتقييم الخصائص الناهضة للمستضدات وتكوين الغشاء النموذجي. يتم إطلاق الإكسوسومات CD63+ وجزيئات الهجوم فوق الجزيئي (SMAPs) أيضا بواسطة الخلايا التائية المحفزة والتقاطها بواسطة BSLBs. يمكن استخدامها كقراءات إضافية للتنشيط وإفراز الحبيبات الخارجية والليزتيكية الناتجة بواسطة الخلايا التائية. كما أن تعبئة الحويصلات الخارجية إلى القطب المتفاعل للخلية التائية تسهل أيضا الإطلاق الاتجاهي للسيتوكينات ، مثل IL-2 و IFN-γ و IL-10 استجابة للتنشيط 4،5،6،7،8. على الرغم من أنه يمكن أيضا اكتشاف السيتوكينات التي تطلق الخلايا التائية على BSLBs ، إلا أنه يجري حاليا تطوير دراسة أكثر تكريسا للتحقق من صحة التحليل الكمي لإطلاق السيتوكين في المشبك المناعي.
لاستجواب كيفية تأثير تركيبات غشائية محددة على الناتج المشبكي للخلايا التائية يتطلب تحديد الكثافة الفسيولوجية لمكون الغشاء المستهدف. تعد القياسات الكمية القائمة على قياس التدفق الخلوي لبروتينات سطح الخلية خطوة أساسية في هذا البروتوكول وتتطلب: 1) استخدام الأجسام المضادة ذات الأعداد المعروفة من الفلوروكرومات لكل جسم مضاد (F / P) ، و 2) الخرز القياسي الذي يوفر مرجعا قياسيا لاستيفاء جزيئات الفلوروكروم من متوسط كثافة التألق المقاسة (MFIs).
تتكون هذه المعايير المرجعية من خمس مجموعات من الخرز ، يحتوي كل منها على عدد متزايد من الفلوروكرومات القابلة للذوبان المكافئة (MESFs) ، والتي تمتد عبر النطاق الديناميكي للكشف الاعتباطي التعسفي. تنتج هذه المجموعات السكانية القياسية قمم فلورية منفصلة ، مما يسهل تحويل وحدات التألق التعسفية إلى MESFs عن طريق الانحدار الخطي البسيط. ثم يتم استخدام MESFs الناتجة جنبا إلى جنب مع قيم الأجسام المضادة F / P لحساب متوسط عدد الجزيئات المرتبطة لكل خلية (أو BSLB في خطوات لاحقة). ثم يتيح تطبيق مساحات سطح الخلية المقدرة على متوسط عدد الجزيئات المكتشفة حساب الكثافات الفسيولوجية كجزيئات/ميكرومتر2. يمكن أيضا تكييف بروتوكول القياس الكمي هذا لقياس كثافات البروتين على الخلايا التائية وإعادة التركيب الكيميائي الحيوي لتركيبات الغشاء التي تتوسط في تكوين نقاط الاشتباك العصبي للخلايا التائية المتجانسة (أي نقاط الاشتباك العصبي T-T9). إذا لزم الأمر ، يمكن زيادة تقدير تكافؤ ارتباط الأجسام المضادة باستخدام أهداف مؤتلفة تحمل أعدادا معروفة من الفلوروكروم لكل جزيء. بعد ذلك ، يمكن حساب التكافؤ المرتبط بالأجسام المضادة لنفس مجموعة BSLB عن طريق مقارنة عدد البروتينات الفلورية المرتبطة والأجسام المضادة الكمي في وقت واحد (باستخدام اثنين مختلفين من الفلوروكرومات الكمية ومعايير MESF).
تتطلب إعادة تكوين أغشية APC تجميع الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة (SLBs) على حبات السيليكا 1. يمكن تسخير مخزونات الجسيمات الشحمية التي تحتوي على أنواع مختلفة من الدهون الفوسفاتية لتشكيل مصفوفة متعددة الاستخدامات ثنائية الطبقة من الدهون ، مما يتيح تثبيت البروتينات المؤتلفة مع كيمياء ربط مختلفة (يتم تفصيل إعداد الجسيمات الشحمية في 10). بمجرد تحديد الكثافة الفسيولوجية (أو الكثافات) للرباط ذي الصلة “على الخلايا” ، يتم تكييف نفس بروتوكول قياس التدفق الخلوي لتقدير تركيز البروتين المؤتلف اللازم لطلاء BSLBs بالكثافة الفسيولوجية المستهدفة. يمكن استخدام نظامي تثبيت مختلفين إما مجتمعين أو بشكل منفصل.
أولا ، SLB الذي يحتوي على 12.5 مول ٪ من الدهون الفوسفاتية المحتوية على Ni2 + يكفي لتوفير ما يقرب من 10000 موقع ربط علامته لكل ميكرون مربع 10 ويعمل بشكل جيد لتزيين BSLBs بمعظم البروتينات المتاحة تجاريا والتي لا تتجاوز كثافاتها الفسيولوجية قدرة التحميل القصوى هذه. يسخر نظام التحميل الثاني الدهون الفوسفاتية المحتوية على البيوتين (مثل مول٪) لتحميل البيوتينيل المضاد ل CD3e Fab (أو مونومرات HLA / MHC) عبر جسور الستربتافيدين. ثم يتيح الجمع بين هاتين الطريقتين للزينة BSLB الخياطة المرنة ل BSLBs كمدادات APCs اصطناعية. بالنسبة للتركيبات السطحية APC المعقدة للغاية ، يمكن زيادة نسبة المول٪ من الدهون الفوسفاتية والبروتينات لتحميل أكبر عدد ممكن من البروتينات التي يتطلبها السؤال المطروح. بمجرد تحديد تركيزات العمل من البروتينات و mol٪ من الدهون الفوسفاتية البيوتينيل ، يمكن تجميع BSLBs لاستجواب الإخراج المشبكي للخلايا التائية باستخدام قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات.
BSLBs هي أدوات متعددة الاستخدامات لدراسة إخراج الجسيمات من الخلايا التائية التي يتم تحفيزها باستخدام أغشية APC النموذجية. تسمح مرونة الطريقة بإعادة تكوين تركيبات الأغشية المعقدة والاختزالية لدراسة آثار الأربطة وإشاراتها على إفراز tSVs وجزيئات الهجوم فوق الجزيئي ومكوناتها. لقد اختبرنا هذه ال…
The authors have nothing to disclose.
نحن ممتنون لأعضاء مختبرنا ومجتمع معهد كينيدي لأمراض الروماتيزم على المناقشات العلمية البناءة ، وخاصة مدير مرفق قياس التدفق الخلوي جوناثان ويبر. تم تمويل هذا العمل من قبل زمالة Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z ، ومنحة ERC المتقدمة (SYNECT AdG 670930) ، وصندوق كينيدي لأبحاث الروماتيزم (KTRR) (الثلاثة إلى MLD). تم دعم PFCD من قبل زمالة EMBO طويلة الأجل (ALTF 1420-2015 ، بالتعاون مع المفوضية الأوروبية (LTFCOFUND2013 ، GA-2013-609409) وماري Sklodowska-Curie Actions) وزمالة أكسفورد-بريستول مايرز سكويب.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) | Avanti Polar Lipids | 790404C-25mg | 18:1 DGS-NTA(Ni) in chloroform |
PIPETMAN L Multichannel P8x200L, 20-200 µL |
Gilson | FA10011 | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375C-25mg | 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) in chloroform |
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 390 | ATTO-TEC | AD 390-165 | DOPE ATTO 390 |
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 488 | ATTO-TEC | AD 488-165 | DOPE ATTO 488 |
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 565 | ATTO-TEC | AD 565-165 | DOPE ATTO 565 |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 870273C-25mg | 18:1 Biotinyl Cap PE in chloroform |
200 µL yellow tips 10 x 96 Tips, Stack | Starlab | S1111-0206 | |
5 mL polystyrene round-bottom tubes | Falcon® | 352052 | |
5.00 ± 0.05 µm non-functionalized silica beads | Bangs Laboratories Inc. | SS05003 | |
96 Well Cell Cultture Plate U-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. | Costar® | 3799 | For FCM staining and co-culture of BSLB and cells. |
96 Well Cell Cultture Plate V-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. | Costar® | 3894 | For FCM staining of cells or beads in suspension. |
Alexa Fluor 488 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ | A20000 | |
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ | A37573 and A20006 | |
Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | For normal in tube staining of biological samples for FCM | |
Aluminum Foil | Any brand | For protecting cells and BSLBs from light | |
anti-human CD154 (CD40L), clone 24-31 | BioLegend | 310815 and 310818 | Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively. |
anti-human CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, clone J252D4 | BioLegend | 356934 | For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E |
anti-human CD19 Brilliant Violet 421, clone HIB19 | BioLegend | 302234 | For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E |
anti-human CD2, clone RPA-2.10 | BioLegend | 300202 | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
anti-human CD2, clone TS1/8 | BioLegend | 309218 | Brilliant Violet 421 conjugate. |
anti-human CD252 (OX40L), clone 11C3.1 | BioLegend | Alexa Fluor 647 conjugate | |
anti-human CD28, clone CD28.2 | eBioscience | 16-0289-85 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
anti-human CD317 (BST2, PDCA-1), clone 26F8 | ThermoFisher Scientific, invitrogen | 53-3179-42 | Alexa Fluor 488 conjugate, we found this clone to be cleaner than clone RS38E. |
anti-human CD38, clone HB-7 | BioLegend | 356624 | Alexa Fluor 700 conjugate |
anti-human CD38, clone HIT2 | BioLegend | 303514 | Alexa Fluor 647 conjugate |
anti-human CD39, clone A1 | BioLegend | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | |
anti-human CD4 Brilliant Violet 650, clone OKT4 | BioLegend | 317436 | For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E |
anti-human CD4, clone A161A1 | BioLegend | 357414 and 357421 | PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively |
anti-human CD4, clone OKT4 | BioLegend | 317414 and 317422 | PE/Cy7 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively |
anti-human CD40, clone 5C3 | BioLegend | 334304 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
anti-human CD40, clone G28.5 | BioLegend | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | |
anti-human CD45, clone HI30 | BioLegend | 304056 and 368516 | Alexa Fluor 647 and APC/Cy7 conjugates |
anti-human CD47, clone CC2C6 | BioLegend | 323118 | Alexa Fluor 647 conjugate |
anti-human CD54 (ICAM-1), clone HCD54 | BioLegend | 322702 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
anti-human CD63 (LAMP-3), clone H5C6 | BioLegend | 353020 and 353015 | PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively |
anti-human CD73, clone AD2 | BioLegend | 344002 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
anti-human CD80, clone 2D10 | BioLegend | 305216 | Alexa Fluor 647 conjugate |
anti-human CD81, clone 5A6 | BioLegend | 349512 and 349502 | PE/Cy7 conjugate and labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), respectively. |
anti-human CD82, clone ASL-24 | BioLegend | 342108 | Alexa Fluor 647 conjugate |
anti-human CD86, clone IT2.2 | BioLegend | 305416 | Alexa Fluor 647 conjugate |
anti-human CD8a, clone HIT8a | BioLegend | 300920 | Alexa Fluor 700 conjugate |
anti-human CD8a, clone SK1 | BioLegend | 344724 | Alexa Fluor 700 conjugate |
anti-human HLA-A/B/C/E, clone w6/32 | BioLegend | 311414 and 311402 | Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
anti-human HLA-DR, clone L243 | BioLegend | 307656 and 307622 | Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively. |
anti-human ICAM-1, clone HCD54 | BioLegend | 322702 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
anti-human ICOS, clone C398.4A | BioLegend | 313516 | Armenian Hamster IgG |
anti-human ICOSL, clone MIH12 | BioLegend | 329611 | Alexa Fluor 647 conjugate |
anti-human ICOSL, clone MIH12 | eBioscience | 16-5889-82 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
anti-human LFA-1, clone TS1/22 | BioLegend | Produced in house | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
anti-human OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35) | BioLegend | 350018 | Alexa Fluor 647 conjugate |
anti-human PD-1 , clone EH12.2H7 | BioLegend | 135230 and 329902 | Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
anti-human PD-L1, clone 29E.2A3 | BioLegend | 329702 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
anti-human PD-L2, clone 24F.10C12 | BioLegend | 329611 | Alexa Fluor 647 conjugate |
anti-human PD-L2, clone MIH18 | BioLegend | 345502 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
anti-human TCRab, clone IP26 | BioLegend | 306712 and 306714 | Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively. |
antti-human CD156c (ADAM10), clone SHM14 | BioLegend | 352702 | |
antti-human CD317 (BST2, Tetherin), clone RS38E | BioLegend | 348404 | Alexa Fluor 647 conjugate |
Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 Isotype control, clone HTK888 | BioLegend | 400902 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
BD Cytometer Setup and Tracking beads | Becton Dickinson & Company (BD) | 641319 | Performance track of instruments before quantitative FCM |
BD FACSDiva | Becton Dickinson & Company (BD) | 23-14523-00 | Acquisition software |
Bovine Seum Albumin | Merck, Sigma-Aldrich | A3294 | |
CaCl2, Calcium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | C5670 | anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0% |
Casein from bovine milk, suitable for substrate for protein kinase (after dephosphorylation), purified powder | Merck, Sigma-Aldrich | C5890 | |
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11132D | |
DynaMag-2 | ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ | 12321D | For the removal of Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 2 mL |
DynaMag™-15 | ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ | 12301D | For the removal of Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 15 mL |
Fetal Bovine Serum Qualified, One Shot | ThermoFisher Scientific, Gibco | A3160801 | Needs heat inactivation for 30 min at 56 oC |
Ficoll-Paque PLUS | Cytiva, GE Healthcare | GE17-1440-02 | Sterile solution of polysaccharide and sodium diatrizoate for lymphocyte isolation |
Fixable Viability Dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | For the exclusion of dead cells during analyses |
FlowJo | Becton Dickinson & Company (BD) | Version 10.7.1 | Analysis software |
Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker | Keison Products | MPS-1 | For the mixing of either cells during stainings or BSLBs during staning or protein loading (as an alternative to orbital agitation) |
HEPES Buffer Solution (1 M) | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-056 | |
HEPES, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid. | Merck, Sigma-Aldrich | H4034 | For preparation of HBS/HAS or HBS/BSA buffer. BioPerformance Certified, ≥99.5% (titration), suitable for cell culture |
HERACell 150i CO2 incubator, 150 L, Electropolished Stainless Steel | ThermoFisher Scientific | 51026282 | For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells. |
Hula Mixer® Sample Mixer | ThermoFisher Scientific, Life Technologies | 15920D | Vertical, variable-angle laboratory mixer used for the mixing of BSLBs and lipid master mix, blocking solutions, protein master mix and small scale antibody stainings. |
Human Serum Albumin, 30% aqueous solution | Merck, Sigma-Aldrich | 12667-M | |
Human TruStain FcX Fc Receptor Blocking Solution | BioLegend | 422302 | Fc Receptor Blocking Solution for blocking of Fc Receptors from biologically relevant samples |
Innovatis CASY cell counter and analyzer TT | Biovendis Products GmbH | For the counting of cells and the determination of cell size and volume based on the exclusion of electric current. | |
KCl, Potassium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | P5405 | Powder, BioReagent, suitable for cell culture |
L-Glutamine 200 mM (100x) | ThermoFisher Scientific, Gibco | 25030-024 | |
MgCl2, Magessium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | M2393 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture |
Microtube Insert for 24 x 1.5/2.0 mL tubes | Keison Products | P-2-24 | Microtube insert for Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker |
Mini Incubator | Labnet International | I5110A-230V | For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2 |
Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11140-035 | |
Mouse IgG polyclonal antibody control | Merck, Sigma-Aldrich | PP54 | Used as positive control for the measurement of antibodies bound to mouse IgG capture bead standards |
Mouse IgG1, k Isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400129, 400112, 400130, 400144, 400128 and 400170 | Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively. |
Mouse IgG1, k Isotype, clone X40 | Becton Dickinson & Company (BD), Horizon | 562438 | Brilliant Violet 421 conjugate. |
Mouse IgG1, κ Isotype control, clone P3.6.2.8.1 | eBioscience | 14-4714-82 | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
Mouse IgG2a, k Isotype, clone MOPC-173 | BioLegend | 400240 | Alexa Fluor 647 conjugate |
Mouse IgG2b, k Isotype, clone MPC-11 | BioLegend | 400330 and 400355 | Alexa Fluor 647 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively |
Multiwell 6 well Tissue culture treated with vacuum gas plasma | Falcon | 353046 | For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells. |
Na2HPO4, Disodium Phosphate | Merck, Sigma-Aldrich | S7907 | |
NaCl, Sodium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | S5886 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99% |
NiSO4, Nickel(II) sulfate | Merck, Sigma-Aldrich | 656895 | For saturating NTA sites; added during the blocking process |
Penicillin Streptomycin [+]10,000 units Penicillin; [+] 10,000 µg/mL Streptomycin | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
Phosphate Buffered Saline pH 7.4, sterile | ThermoFisher Scientific, Gibco | 10010 | No Ca2+ or Mg2+ added |
Polyethersulfone (PES) Filter unit | Thermo Scientific Nalgene | UY-06730-43 | Hydrophilic PES membrane with low protein binding facilitates the filtering of solutions with high protein content |
PURESHIELD argon ISO 14175-I1-Ar | BOC Ltd. | 11-Y | For the protection of lipid stocks stored at +4 ºC. |
Purified Streptavidin | BioLegend | 280302 | |
Quantum Alexa Fluor 488 MESF beads | Bangs Laboratories Inc. | 488 | Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 488 molecules bound to cells and/or BSLB |
Quantum Alexa Fluor 647 MESF beads | Bangs Laboratories Inc. | 647 | Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 647 molecules bound to cells and/or BSLB |
Rat anti-mouse IgG Kappa Light Chain, clone OX-20 | ThermoFisher Scientific, invitrogen | SA1-25258 | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
Recombinant human IL-2 | Peprotech | 200-02-1MG | |
RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-Glutamine | ThermoFisher Scientific, Gibco | 31870-025 | |
Rosette Human B Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15064 | Isolation of B cells for measuring densities of proteins in purified cell populations |
Rosette Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15022C.1 | |
Rosette Human CD4+CD127low T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15361 | Pre-enrichment of CD4+ CD127Low T cells for the downstream isolation of Tregs by FACS. |
Rosette Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15063 | |
RPMI Medium 1640 (1x); [-] Phenol Red | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11835-063 | For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2. Phenol red-free media reduces the autofluorescence of cells in flow cytometry and microscopy based measurements. |
Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11360-070 | |
Sprout mini centrifuge | FisherScientific, Heathrow Scientific LLC | 120301 | Benchtop microcentrifuge used to wash silica beads and BSLB in 1.5 mL Eppendorf tubes. |
Sterile cappeed 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Falcon | 352058 | |
UltraComp eBeads Compensation Beads | ThermoFisher Scientific, invitrogen | 01-2222-42 | |
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ | 89882 |