İmmobilize Tropomiyozin Kinaz Reseptörü B ile Etkileşime Giren Özel Bitki Metabolitlerini Tanımlamak için Hücresel Membran Afinite Kromatografisi Sütunları

Botanik karışımlar, farmakolojik olarak aktif bileşikler¹ bakımından zengindir ve yeni ilaç isabetlerinin tanımlanması için iyi bir kaynak görevi görür ve 2,3,4,5’e yol açar. Doğal ürünlerden yeni ilaçların keşfi verimli bir yaklaşım olmuştur ve şu anda onaylanmış birçok ilaç, ilk olarak doğada tanımlanan bileşiklerden kaynaklanmaktadır. Doğal bileşiklerin kimyasal çeşitliliğinin, kimyasal olarak sentezlenmiş moleküllerin insan yapımı kütüphaneleri ile eşleştirilmesi zordur. Birçok doğal bileşik, insan protein hedefleriyle etkileşime girer ve modüle eder ve evrimsel olarak optimize edilmiş ilaç benzeri moleküller olarak düşünülebilir⁶. Bu doğal bileşikler, nörolojik bozukluklarda kullanılmak üzere ilaç kurşun tanımlaması için özellikle uygundur⁶. Alzheimer hastalığının (AD) yönetimi için şu anda FDA onaylı ilaçlardan ikisi doğal alkaloitlerden türetilmiştir, yani: galantamin ve rivastigmin (fizikostigmin türevi)⁶. Şu anda Parkinson hastalığı için en sık reçete edilen ilaç olan L-DOPA, ilk olarak geniş fasulyeden (Vicia faba L.) tanımlanmıştır. ⁷. Pergolid ve lisürid, dopaminerjik reseptör agonistleri, parazitik mantar Claviceps purpurea^8’den doğal ergot alkaloidlerinin türevleridir. Hint yılan kökünden izole edilmiş bir alkaloid olan Reserpin (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) ilk antipsikotik ilaçlardan biriydi⁹. Son zamanlarda, düzensiz immün yanıt ve sistemik inflamasyon, majör depresif bozukluk veya nörodejeneratif hastalıklar gibi çok sayıda nörolojik rahatsızlığın gelişimi ile ilişkilendirilmiştir¹⁰. Diğer yaşam tarzı müdahaleleriyle birlikte bitki bazlı bir diyetin yaşlılarda bilişsel ve işlevsel yetenekleri geliştirdiği bulunmuştur 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Triterpenlere ve polifenollere ait bazı elektrofilik moleküllerin hem in vitro hem de in vivo modellerde inflamatuar yanıtları modüle ettiği bulunmuştur¹². Örneğin, α.β doymamış karbonil (örneğin, kurkumin, sinnamaldehit) veya izotiyosiyanat grubu (örneğin, sülforafan) içeren doğal bileşikler, murin interlökin-3 bağımlı pro-B hücre hattında pro-inflamatuar sitokinlerin aşağı akış sentezini inhibe eden Toll benzeri reseptör-4 (TLR4) dimerizasyonuna müdahale eder^12,22 . Epidemiyolojik kanıtlar, karmaşık gıda matrislerinde bulunan diyet fitokimyasallarının da yeni ilaç kurşunlarının uygulanabilir bir kaynağını oluşturabileceğini güçlü bir şekilde göstermektedir⁶.

Bitki bazlı gıdalar da dahil olmak üzere bitki özlerinde bulunan biyolojik olarak aktif moleküllerin tanımlanmasındaki en büyük engellerden biri, araştırılan örneklerin karmaşıklığıdır. Geleneksel olarak, bireysel bileşikler izole edilir, saflaştırılır ve daha sonra biyolojik aktivite için test edilir. Bu yaklaşım genellikle en bol ve iyi karakterize edilen bileşiklerin tanımlanmasına yol açar. Tanımlanmış bir moleküler hedef olmadan fenotipik ilaç keşif yaklaşımları, karmaşık karışımların biyo-kılavuzlu fraksiyonasyonuna dayanır²³. Bu yaklaşımda, bir ekstrakt, daha sonra fenotipik tahlillerde test edilen daha az karmaşık alt fraksiyonlara bölünür. Aktif bileşiklerin izolasyonu ve saflaştırılması, tahlilde doğrulanan biyolojik aktivite tarafından yönlendirilir. Belirli bir ilaç hedefinin kimliğinin bilinmesi, karmaşık karışımlarda bulunan farmakolojik olarak aktif bileşiklerin tanımlanmasını önemli ölçüde hızlandırabilir. Bu yaklaşımlar genellikle moleküler hedefin, örneğin bir enzimin, manyetik boncuklar gibi katı bir yüzeyde immobilizasyonuna dayanır²³. Hareketsiz hedefler daha sonra tarama deneylerinde kullanılır ve hedef ile etkileşime giren bileşiklerin izolasyonu ile sonuçlanır. Bu yaklaşım, sitozolik proteinleri hedef alan bileşiklerin tanımlanmasında yaygın olarak kullanılmasına rağmen, transmembran proteinleri (TMP’ler) ile etkileşime giren kimyasalların tanımlanmasında daha az yaygın olarak ^{uygulanmıştır.23}. TMP’lerin immobilizasyonundaki ek bir zorluk, proteinin aktivitesinin hücre zarı fosfolipitleri ve kolesterol^23,24 gibi çift katmandaki diğer moleküllerle etkileşimine bağlı olmasından kaynaklanmaktadır. Transmembran hedefini hareketsiz hale getirmeye çalışırken proteinler ve doğal fosfolipid çift katmanlı ortamları arasındaki bu ince etkileşimleri korumak önemlidir.

Hücresel membran afinite kromatografisinde (CMAC) hücre zarı fragmanları ve saflaştırılmış proteinler değil, yapay membran (IAM) sabit faz parçacıkları²³ üzerinde hareketsiz hale getirilir. IAM durağan fazları, fosfatidilkolin analoglarının silika üzerine kovalent olarak bağlanmasıyla hazırlanır. Son zamanlarda, serbest amin ve silanol gruplarının uçtan kapatıldığı yeni IAM durağan faz sınıfları geliştirilmiştir (IAM. Kişisel bilgisayar. DD2 parçacıkları). CMAC kolonları sırasında hücre zarı fragmanları hazırlanması, adsorpsiyon yoluyla IAM parçacıklarının yüzeyine hareketsiz hale getirilir.

CMAC sütunları, iyon kanalları (örneğin, nikotinik reseptörler), GPCR’ler (örneğin, opioid reseptörleri), protein taşıyıcıları (örneğin, p-glikoprotein) vb. dahil olmak üzere farklı TMP sınıflarını immobilize etmek için bugüne kadar ^{kullanılmıştır.} İmmobilize protein hedefleri, farmakodinamiklerin karakterizasyonunda (örneğin, ayrışma sabiti, Kd) veya hedefle etkileşime giren küçük moleküllü ligandların bağlanma kinetiğinin (k_açık ve k_kapalı) belirlenmesinde ve ayrıca karmaşık matrislerde bulunan potansiyel yeni ilaç uçlarının tanımlanması sürecinde kullanılmıştır²⁴ . Burada, çok sayıda sinir sistemi bozukluğu için ilaç keşfi için uygun bir hedef olarak ortaya çıkan immobilize tropomiyozin kinaz reseptörü B (TrkB) ile CMAC kolonlarının hazırlanması sunulmaktadır.

Önceki çalışmalar, beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) / TrkB yolunun aktivasyonunun, AD veya majör depresif bozukluk^25,26,27,28 gibi bazı nörolojik rahatsızlıkların iyileşmesi ile ilişkili olduğunu göstermiştir. BDNF düzeylerinin ve reseptör TrkB ekspresyonunun AD’de azaldığı, benzer azalmaların MS²⁹ hayvan modellerinde hipokampal fonksiyonu bozduğu bildirilmiştir. AD hastalarının serum ve beyninde BDNF düzeylerinde azalma bildirilmiştir^30,31,32. Tau aşırı ekspresyonu veya hiperfosforilasyonun, primer nöronlarda BDNF ekspresyonunu aşağı regüle ettiği ve AD hayvan modellerinde^33,34,35 olduğu bulunmuştur. Ek olarak, BDNF’nin β-amiloid kaynaklı nörotoksisite in vitro ve in vivo³⁶ üzerinde koruyucu etkileri olduğu bildirilmiştir. Sıçan beynine doğrudan BDNF uygulanmasının bilişsel olarak bozulmuş hayvanlarda öğrenme ve hafızayı arttırdığı gösterilmiştir³⁷. BDNF/TrkB, AD^28,38 dahil olmak üzere nörolojik ve psikiyatrik bozuklukların iyileştirilmesinde geçerli bir hedef olarak ortaya çıkmıştır. AD’de tedavilerin geliştirilmesi için BDNF / TrkB sinyal yolunu hedeflemek, potansiyel olarak hastalık hakkındaki anlayışımızı geliştirecektir³⁹. Ne yazık ki, BDNF’nin kendisi zayıf farmakokinetik özellikleri ve olumsuz yan etkileri nedeniyle bir tedavi olarak kullanılamaz⁴⁰. TrkB/BDNF yolaklarının küçük molekül aktivatörleri potansiyel TrkB ligandları ^41,42,43 olarak araştırılmıştır. Test edilen küçük molekül agonistleri arasında, 7,8-dihidroksiflavonun (7,8-DHF), BDNF / TrkB yolunu^41,44,45,46 aktive ettiği gösterilmiştir. 7,8-DHF’nin bir türevi (R13; 4-Oxo-2-fenil-4H-kromen-7,8-diyl bis (metilkarbamat)) şu anda AD⁴⁷ için olası bir ilaç olarak değerlendirilmektedir. Son zamanlarda, birkaç antidepresanın TrkB’ye doğrudan bağlanarak ve BDNF sinyallemesini teşvik ederek çalıştığı ve TrkB’yi çeşitli nörolojik bozuklukları tedavi etmek için geçerli bir hedef olarak takip etmenin önemini vurguladığı gösterilmiştir⁴⁸.

Protokol, işlevsel TrkB sütunu ve TrkB-NULL negatif kontrol sütununun birleştirilmesi işlemini açıklar. Kolonlar, bilinen bir doğal ürün küçük-moleküler ligand kullanılarak karakterize edilir: 7,8-DHF. Ek olarak, TrkB ile etkileşime giren bileşiklerin tanımlanması için bitki ekstraktını örnek olarak kullanarak karmaşık matrislerin taranması sürecini açıklıyoruz.