Colonne di cromatografia di affinità della membrana cellulare per identificare metaboliti vegetali specializzati che interagiscono con il recettore della tropomiosina chinasi B immobilizzato

Le miscele botaniche sono ricche di composti farmacologicamente attivi¹, che fungono da buona fonte per l’identificazione di nuovi colpi di farmaci e conduce 2,3,4,5. La scoperta di nuovi farmaci da prodotti naturali è stato un approccio fruttuoso e molti farmaci attualmente approvati hanno avuto origine da composti identificati per la prima volta in natura. La diversità chimica dei composti naturali è difficile da eguagliare nelle librerie artificiali di molecole sintetizzate chimicamente. Molti composti naturali interagiscono e modulano bersagli proteici umani e possono essere considerati molecole simili a farmaci ottimizzate evolutivamente⁶. Questi composti naturali sono particolarmente adatti per l’identificazione del piombo farmacologico da utilizzare nei disturbi neurologici⁶. Due dei farmaci attualmente approvati dalla FDA per la gestione della malattia di Alzheimer (AD) sono derivati da alcaloidi naturali, vale a dire: galantamina e rivastigmina (un derivato della fisostigmina)⁶. L-DOPA, attualmente il farmaco più comunemente prescritto per il morbo di Parkinson, è stato identificato per la prima volta dalla fava (Vicia faba L.) ⁷. Pergolide e lisuride, agonisti del recettore dopaminergico sono i derivati degli alcaloidi naturali della segale cornuta dal fungo parassita Claviceps purpurea⁸. Reserpina, un alcaloide isolato dalla radice di serpente indiana (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) è stato uno dei primi farmaci antipsicotici⁹. Recentemente, la risposta immunitaria disregolata e l’infiammazione sistemica sono state collegate allo sviluppo di numerosi disturbi neurologici, come il disturbo depressivo maggiore o le malattie neurodegenerative¹⁰. Una dieta a base vegetale insieme ad altri interventi sullo stile di vita è stata trovata per migliorare le capacità cognitive e funzionali negli anziani ^{11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21} . Alcune molecole elettrofile appartenenti a triterpeni e polifenoli sono state trovate per modulare le risposte infiammatorie sia in vitro che in vivo modelli¹². Ad esempio, i composti naturali contenenti α.β-insaturo carbonile (ad esempio, curcumina, cinnamaldeide) o gruppo isotiocianato (ad esempio, sulforafano) interferiscono con la dimerizzazione del recettore Toll-like-4 (TLR4) inibendo la sintesi a valle di citochine pro-infiammatorie in una linea cellulare pro-B murina interleuchina-3 dipendente^12,22 . Le evidenze epidemiologiche indicano fortemente che i fitochimici dietetici, presenti in matrici alimentari complesse, possono anche costituire una valida fonte di nuovi lead farmacologici⁶.

Uno dei maggiori ostacoli nell’identificazione di molecole biologicamente attive presenti negli estratti vegetali, compresi gli alimenti a base vegetale, è la complessità dei campioni indagati. Tradizionalmente, i singoli composti vengono isolati, purificati e successivamente testati per l’attività biologica. Questo approccio di solito porta all’identificazione dei composti più abbondanti e ben caratterizzati. Gli approcci fenotipici alla scoperta di farmaci senza un bersaglio molecolare definito si basano sul frazionamento bioguidato di miscele complesse²³. In questo approccio, un estratto viene frazionato in sottofrazioni meno complesse che vengono successivamente testate in saggi fenotipici. L’isolamento e la purificazione dei composti attivi sono guidati dall’attività biologica verificata nel test. La conoscenza dell’identità di un bersaglio farmacologico specifico può accelerare significativamente l’identificazione di composti farmacologicamente attivi presenti in miscele complesse. Questi approcci sono solitamente basati sull’immobilizzazione del bersaglio molecolare, ad esempio un enzima, su una superficie solida, come le perle magnetiche²³. I bersagli immobilizzati vengono successivamente utilizzati negli esperimenti di screening con conseguente isolamento di composti che interagiscono con il bersaglio. Mentre questo approccio è stato ampiamente utilizzato nell’identificazione di composti mirati alle proteine citosoliche, è stato applicato meno comunemente nell’identificazione di sostanze chimiche che interagiscono con le proteine transmembrana (TMP)²³. Un’ulteriore sfida nell’immobilizzazione dei TMP deriva dal fatto che l’attività della proteina dipende dalla sua interazione con i fosfolipidi della membrana cellulare e altre molecole nel doppio strato come il colesterolo^23,24. È importante preservare queste sottili interazioni tra le proteine e il loro ambiente nativo fosfolipidico a doppio strato quando si tenta di immobilizzare il bersaglio transmembrana.

Nella cromatografia di affinità di membrana cellulare (CMAC) i frammenti di membrana cellulare, e non le proteine purificate, sono immobilizzati sulla membrana artificiale (IAM) particelle di fase stazionaria²³. Le fasi stazionarie IAM sono preparate legando covalentemente gli analoghi della fosfatidilcolina sulla silice. Recentemente sono state sviluppate nuove classi di fasi stazionarie IAM in cui i gruppi di ammine e silanoli liberi sono end-capped (IAM. PC. Particelle DD2). Durante la preparazione delle colonne CMAC i frammenti di membrana cellulare vengono immobilizzati sulla superficie delle particelle IAM attraverso l’adsorbimento.

Le colonne CMAC sono state utilizzate fino ad oggi per immobilizzare diverse classi di TMP, inclusi i canali ionici (ad esempio, recettori nicotinici), GPCR (ad esempio, recettori oppioidi), trasportatori di proteine (ad esempio, p-glicoproteina), ^ecc.24. I bersagli proteici immobilizzati sono stati utilizzati nella caratterizzazione della farmacodinamica (ad esempio, costante di dissociazione, Kd) o nella determinazione della cinetica di legame (k_on e k_off) di ligandi di piccole molecole che interagiscono con il bersaglio, nonché nel processo di identificazione di potenziali nuovi lead farmacologici presenti in matrici complesse²⁴ . Qui presentiamo la preparazione di colonne CMAC con il recettore immobilizzato della tropomiosina chinasi B (TrkB), che è emerso come un bersaglio praticabile per la scoperta di farmaci per numerosi disturbi del sistema nervoso.

Studi precedenti hanno dimostrato che l’attivazione del fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF)/TrkB è associata al miglioramento di alcuni disturbi neurologici, come l’AD o il disturbo depressivo maggiore 25,26,27,28. È stato riportato che i livelli di BDNF e il suo recettore TrkB di espressione diminuiscono nell’AD e riduzioni simili compromettono la funzione dell’ippocampo in modelli animali di AD²⁹. Livelli ridotti di BDNF sono stati riportati nel siero e nel cervello dei pazienti con AD 30,31,32. La sovraespressione di Tau o l’iperfosforilazione sono state trovate per down-regolare l’espressione di BDNF nei neuroni primari e modelli animali di AD ^33,34,35. Inoltre, è stato segnalato che il BDNF ha effetti protettivi sulla neurotossicità indotta da β-amiloide in vitro e in vivo³⁶. La somministrazione diretta di BDNF nel cervello del ratto ha dimostrato di aumentare l’apprendimento e la memoria negli animali cognitivamente compromessi³⁷. BDNF / TrkB è emerso come un obiettivo valido per migliorare i disturbi neurologici e psichiatrici tra cui AD^28,38. Prendere di mira la via di segnalazione BDNF / TrkB per lo sviluppo di terapie nell’AD migliorerà potenzialmente la nostra comprensione della malattia³⁹. Sfortunatamente, il BDNF stesso non può essere usato come trattamento a causa delle sue scarse proprietà farmacocinetiche e degli effetti collaterali avversi⁴⁰. Gli attivatori di piccole molecole delle vie TrkB/BDNF sono stati esplorati come potenziali ligandi TrkB 41,42,43. Tra gli agonisti di piccole molecole testati, il 7,8-diidrossiflavone (7,8-DHF), ha dimostrato di attivare la via BDNF/TrkB 41,44,45,46. Un derivato del 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-fenil-4H-cromone-7,8-diil bis(metilcarbammato)) è attualmente in esame come possibile farmaco per l’AD⁴⁷. Recentemente, è stato dimostrato che diversi antidepressivi agiscono attraverso il legame diretto al TrkB e la promozione della segnalazione BDNF, sottolineando ulteriormente l’importanza di perseguire TrkB come obiettivo valido per il trattamento di vari disturbi neurologici⁴⁸.

Il protocollo descrive il processo di assemblaggio della colonna TrkB funzionale e della colonna di controllo negativo TrkB-NULL. Le colonne sono caratterizzate utilizzando un noto prodotto naturale legante molecolare piccolo: 7,8-DHF. Inoltre, descriviamo il processo di screening di matrici complesse, utilizzando l’estratto vegetale come esempio, per l’identificazione di composti che interagiscono con TrkB.