细胞膜亲和色谱柱鉴定与固定化托肌球蛋白激酶受体B相互作用的特化植物代谢物

植物混合物富含药理活性化合物¹，可作为鉴定新药命中和先导联^2，3，^4，5的良好来源。从天然产物中发现新药是一种富有成效的方法，许多目前批准的药物来自自然界中首先鉴定的化合物。天然化合物的化学多样性很难与人造化学合成分子库相匹配。许多天然化合物与人类蛋白质靶标相互作用并调节人类蛋白质靶标，并且可以被认为是进化优化的类药物分子⁶。这些天然化合物特别适合于药物先导物鉴定，以用于神经系统疾病⁶。目前FDA批准的两种用于治疗阿尔茨海默病（AD）的药物来自天然生物碱，即：加兰他敏和卡巴拉汀（毒扁豆碱的衍生物）⁶。L-DOPA 是目前帕金森病最常用的处方药，首先从蚕豆（Vicia faba L.）中鉴定出来。⁷.高臼和赖脲，多巴胺能受体激动剂是来自寄生真菌Claviceps purpurea⁸的天然麦角生物碱的衍生物。利血平，一种从印度蛇根（Rauvolfia serpentina （L.） Benth. ex Kurz）分离出来的生物碱，是最早的抗精神病药物之一⁹.最近，失调的免疫反应和全身炎症已经与许多神经系统疾病的发展有关，例如重度抑郁症或神经退行性疾病¹⁰。已发现植物性饮食与其他生活方式干预相结合可以改善老年人的认知和功能能力^{11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21}.已经发现属于三萜烯和多酚的某些亲电分子在体外和体内模型¹²中调节炎症反应。例如，含有α，β不饱和羰基（例如姜黄素，肉桂醛）或异硫氰酸酯基团（例如萝卜硫素）的天然化合物会干扰Toll样受体-4（TLR4）二聚化，从而抑制小鼠白细胞介素-3依赖性pro-B细胞系中促炎细胞因子的下游合成^12，22.流行病学证据强烈指出，存在于复杂食物基质中的膳食植物化学物质也可能构成新药先导物的可行来源⁶。

鉴定植物提取物（包括植物性食物）中存在的生物活性分子的主要障碍之一是所研究样品的复杂性。传统上，单个化合物被分离，纯化，然后测试生物活性。这种方法通常导致鉴定最丰富和最有特征的化合物。没有明确分子靶点的表型药物发现方法依赖于复杂混合物的生物引导分馏²³。在这种方法中，将提取物分馏成不太复杂的亚级分，随后在表型测定中进行测试。活性化合物的分离和纯化由测定中验证的生物活性指导。对特定药物靶标的特性的了解可以显着加快复杂混合物中存在的药理活性化合物的鉴定。这些方法通常基于分子靶标的固定化，例如酶，在固体表面上，如磁珠²³。固定的靶标随后用于筛选实验，从而分离出与靶标相互作用的化合物。虽然这种方法已被广泛用于鉴定靶向胞质蛋白的化合物，但它在鉴定与跨膜蛋白（TMP）相互作用的化学物质方面不太常见²³。TMP固定化的另一个挑战源于蛋白质的活性取决于其与细胞膜磷脂和双层中其他分子（如胆固醇^23，24）的相互作用。在试图固定跨膜靶标时，重要的是要保留蛋白质与其天然磷脂双层环境之间的这些微妙相互作用。

在细胞膜亲和色谱（CMAC）中，细胞膜片段，而不是纯化的蛋白质，被固定在人工膜（IAM）固定相颗粒²³上。通过将磷脂酰胆碱类似物共价键合到二氧化硅上来制备IAM固定相。最近开发了新型的IAM固定相类，其中游离胺和硅醇基团是端封的（IAM.个人电脑。DD2 粒子）。在CMAC色谱柱制备过程中，细胞膜片段通过吸附固定在IAM颗粒的表面上。

迄今为止，CMAC色谱柱已被用于固定不同类别的TMP，包括离子通道（例如烟碱受体），GPCRs（例如，阿片受体），蛋白质转运蛋白（例如，p-糖蛋白）等^。固定化的蛋白质靶标已用于表征药效学（例如，解离常数，Kd）或确定与靶标相互作用的小分子配体的结合动力学（k_开 和k_关），以及鉴定复杂基质中存在的潜在新药先导物的过程²⁴.在这里，我们介绍了具有固定化对肌球蛋白激酶受体B（TrkB）的CMAC柱的制备，该受体已成为许多神经系统疾病的药物发现的可行靶标。

先前的研究表明，脑源性神经营养因子（BDNF）/ TrkB通路的激活与某些神经系统疾病的改善有关，例如AD或重性抑郁障碍^{25，26，27，28}。据报道，在AD中，BDNF水平及其受体TrkB表达降低，类似的减少损害了AD²⁹动物模型中的海马功能。据报道，AD患者的血清和大脑中BDNF水平降低^30，31，32。发现Tau过表达或高磷酸化可下调原代神经元和AD动物模型中的BDNF表达^33，34，35。此外，据报道，BDNF对β-淀粉样蛋白诱导 的体外 和 体内³⁶的神经毒性具有保护作用。直接将BDNF施用于大鼠大脑被证明可以增加认知受损动物的学习和记忆^力37。BDNF / TrkB成为改善神经和精神疾病的有效目标，包括AD^28，38。靶向BDNF / TrkB信号通路以开发AD中的疗法可能会增强我们对疾病的理解³⁹。不幸的是，BDNF本身不能用作治疗，因为它的药代动力学性质差和不良副作用⁴⁰。TrkB / BDNF途径的小分子激活剂已被探索为潜在的TrkB配体^41，42，43。在测试的小分子激动剂中，7，8-二羟基黄酮（7，8-DHF）已被证明可以激活BDNF / TrkB途径^{41，44，45，46}。7，8-DHF（R13;4-氧代-2-苯基-4H-铬-7，8-二基双（甲基氨基甲酸酯））的衍生物目前正在考虑作为AD⁴⁷的可能药物。最近，研究表明，几种抗抑郁药通过直接与TrkB结合并促进BDNF信号传导起作用，进一步强调了追求TrkB作为治疗各种神经系统疾病的有效靶点的重要性⁴⁸。

该协议描述了组装功能TrkB柱和TrkB-NULL阴性对照柱的过程。使用已知的天然产物小分子配体：7，8-DHF来表征色谱柱。此外，我们描述了筛选复杂基质的过程，以植物提取物为例，用于鉴定与TrkB相互作用的化合物。