Implantation et contrôle de systèmes sans fil et sans batterie pour l’interfaçage des nerfs périphériques

Toutes les procédures décrites dans ce protocole sont effectuées conformément au Guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Northwestern. Ce protocole suit les directives de soins aux animaux du Centre de médecine comparative de l’Université Northwestern et de l’IACUC. Il est nécessaire de consulter l’IACUC lors de l’adaptation des protocoles. 1. Fabrication d’un stimulateur électronique sans fil (Figure 2) Utilisez du cuivre/polyimide/cuivre (cuivre supérieur et inférieur de 18 μm d’épaisseur, polyimide de 75 μm d’épaisseur) comme substrat pour la bobine du collecteur d’énergie radiofréquence (c’est-à-dire l’antenne de réception sans fil). Utilisez l’ablation laser directe pour tracer les trous des électrodes sur les couches de cuivre supérieures et inférieures et façonner l’appareil. Connectez électriquement les couches supérieure et inférieure à l’aide de pâte d’argent à travers les trous. Fixez les composants électroniques avec un emballage commercial, tel qu’une diode et un condensateur, par soudure. Utiliser le molybdène encapsulé en polyuréthane covalent dynamique biorésorbable (b-DCPU ; 200 μm d’épaisseur) comme électrodes d’extension extensibles19. Former l’électrode du ballonnet pour l’interface entre le dispositif et le nerf à l’aide d’un film poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA) (300 μm d’épaisseur). Après avoir connecté l’antenne du récepteur sans fil et l’électrode d’extension extensible, encapsulez l’antenne du récepteur sans fil et la connexion avec de l’époxy étanche ou du polydiméthysiloxane (PDMS) commercialisé. Reportez-vous à la figure 2 (à droite) pour l’appareil entièrement assemblé. Confirmez le fonctionnement sans fil de l’appareil, en utilisant un générateur de forme d’onde pour générer des impulsions électriques monophasiques via la bobine primaire (c’est-à-dire la bobine de transmission).REMARQUE : En examinant le recrutement des axones périphériques et l’induction de la régénération axonale par des stimuli monophasiques et biphasiques, des études antérieures ont rapporté un effet négligeable en raison des différences dans la caractéristique de forme d’onde20, et ce groupe a été en mesure d’obtenir une amélioration thérapeutique de la stimulation électrique avec les mêmes paramètres de courant monophasique chez les souris21 et les rats18. De plus, des études antérieures ont examiné la biocompatibilité in vivo et in vitro et n’ont trouvé aucune preuve de lésions tissulaires dues aux effets de la chaleur ou aux matériaux eux-mêmes. En raison de ces résultats et de la durée limitée de la stimulation électrique thérapeutique dans la présente étude, des stimuli monophasiques, plutôt que biphasiques, ont été utilisés dans ce protocole. Mesurez la tension de sortie en courant continu résultante à l’aide d’un oscilloscope connecté à l’électrode du brassard. 2. Préparation du dispositif pour l’implantation Placez les dispositifs implantaires dans une boîte de Pétri stérile et scellez-la avec du parafilm. Irradiez les appareils avec de la lumière UV pendant 30 min de chaque côté. 3. Intervention chirurgicale de l’implantation du nerf sciatique droit du rat de l’interface nerveuse périphérique sans fil et sans pile pour la stimulation électrique (Figure 3) REMARQUE : Maintenir des conditions stériles. Effectuer des interventions chirurgicales dans la zone chirurgicale désignée d’une salle d’intervention pour animaux. Le chirurgien enfilera un masque facial, un manteau, une casquette et des gants stériles pendant la chirurgie. Si plus d’une intervention chirurgicale est effectuée, changez de gants stériles entre les animaux et utilisez des instruments chirurgicaux propres et stériles pour chaque chirurgie. Stériliser les outils entre les chirurgies par stérilisation à la chaleur (autoclave ou stérilisateur à billes de verre). Utilisez des rats Sprague-Dawley adultes pesant entre 200 et 250 g. Induire l’anesthésie à l’aide d’une anesthésie gazeuse à base d’isoflurane (3 % d’induction, 1 à 3 % d’entretien) dans de l’oxygène (2 L/min), avec administration sous-cutanée de méloxicam (1-2 mg/kg). Couvrez les yeux des rats avec une pommade ophtalmique désignée pour éviter qu’ils ne se dessèchent. Placez les rats en position couchée sur des tables d’opération désinfectées pour les procédures ultérieures. Pour la durée restante de la chirurgie, évaluez la fréquence respiratoire (doit être de ~2/s), la couleur des tissus et la profondeur de l’anesthésie au moins toutes les 15 minutes, et maintenez les niveaux d’isoflurane en conséquence. Confirmez la profondeur appropriée de l’anesthésie en vérifiant le réflexe de la pédale (absence de réponse à un pincement ferme de l’orteil). Surveillez les muqueuses, qui doivent rester roses et humides. Rasez la zone chirurgicale, y compris la jambe droite et la moitié inférieure du dos. Frottez la zone chirurgicale rasée avec un tampon de bétadine, suivi d’un écouvillon à l’éthanol médical à 70%, et répétez ce processus de gommage trois fois pour la désinfection de la peau. Faites une incision de 1,5 à 2 cm dans la peau parallèle à l’os du fémur droit à l’aide de ciseaux tissulaires, suivie d’une séparation émoussée du tissu conjonctif sous-cutané à l’arrière (directement médiale à l’incision) pour dégager une poche sous-cutanée pour la bobine réceptrice (Figure 4A). Faites une incision subséquente (1,2-1,5 cm) sur le muscle fessier droit parallèle à l’incision cutanée. Isolez délicatement le nerf sciatique à l’aide de sondes de dissection métalliques à extrémités émoussées (Figure 4B).REMARQUE : Le nerf sciatique est situé profondément au biceps fémoral et est parallèle au fémur. Une lunette de dissection est suggérée. Implantez le dispositif sans fil et sans pile sur le nerf sciatique (Figure 4C) en enroulant le brassard autour du nerf sciatique droit isolé, sans mettre le nerf sous tension ni déformer son trajet 18,19,20. Marquez sur la peau l’endroit où la bobine réceptrice est placée pour une stimulation électrique supplémentaire. Suturez l’incision du muscle fessier à l’aide de sutures résorbables (Figure 4D).REMARQUE : La moitié supérieure de la bobine réceptrice se trouve au-dessus du muscle fessier et de l’interface du brassard en dessous. Fermez l’incision cutanée avec des pinces à plaie (ou une suture enterrée ; Graphique 4E). Faites correspondre les bords de la peau. Délivrer 1 h de stimulation électrique postopératoire continue à 20 Hz avec une largeur d’impulsion de 200 μs sous anesthésie (Figure 4F). Remettez les animaux dans leurs cages d’origine une fois qu’ils se sont complètement rétablis de l’anesthésie.REMARQUE : Le protocole détaillé est décrit ci-dessous. La bobine réceptrice est représentée au-dessus de la peau de la figure 4F. Traitement post-chirurgicalPlacez le rat dans une cage de récupération sans litière, tapissée d’essuie-tout, avec la moitié de la cage placée sur une source de chaleur appropriée à température régulée (coussin chauffant approuvé). Surveillez attentivement le rat jusqu’à ce qu’il soit ambulatoire. Une fois qu’il est ambulatoire et que son état est stable, remettez le rat dans sa cage d’origine et surveillez sa réinsertion sociale. Après une récupération aiguë, surveillez les rats pour détecter l’infection du site d’incision et les symptômes de douleur neurogène, y compris, mais sans s’y limiter, la protection, la torsion, le grattage et l’automutilation. Surveillez les rats tous les jours pendant la période de récupération post-chirurgicale de 5 jours, et au moins une fois tous les trois jours par la suite si les rats ne sont pas sacrifiés au jour 5. Administrer du méloxicam (1 à 2 mg/kg) par voie sous-cutanée une fois par jour pendant deux à trois jours après la chirurgie, selon le niveau de douleur ou d’inconfort de l’animal. Si une douleur persistante est suspectée, poursuivre le méloxicam au-delà de cette période postopératoire, et si elle s’avère réfractaire, euthanasier le rat tôt en consultation avec l’équipe vétérinaire. Retirez les sutures cutanées ou les clips de plaie 10 à 12 jours après la chirurgie. 4. Intervention chirurgicale de l’implantation du nerf phrénique gauche de rat de stimulateurs sans fil (Figure 5A) REMARQUE : Maintenir des conditions stériles, comme dans la section 3. Utilisez des rats Sprague-Dawley adultes pesant de 200 à 250 g. Stérilisez tous les outils chirurgicaux avant utilisation. Induire l’anesthésie à l’aide d’une anesthésie gazeuse à base d’isoflurane (3 % d’induction, 1 à 3 % d’entretien) dans de l’oxygène (2 L/min), avec administration sous-cutanée de méloxicam (1-2 mg/kg). Couvrez les yeux du rat avec une pommade ophtalmique désignée pour éviter la dessiccation. Placez les rats en décubitus dorsal sur des tables d’opération désinfectées pour les procédures ultérieures. Pour la durée restante de la chirurgie, évaluez la fréquence respiratoire, la couleur des tissus et la profondeur de l’anesthésie au moins toutes les 15 minutes et maintenez les niveaux d’isoflurane en conséquence. Confirmez la profondeur appropriée de l’anesthésie en vérifiant le réflexe de la pédale (absence de réponse à un pincement ferme de l’orteil). Surveillez les muqueuses, qui doivent rester roses et humides. Rasez la zone chirurgicale sur la face ventrale du cou. Frottez la zone chirurgicale rasée avec un tampon de bétadine, suivi d’un écouvillon à l’éthanol médical à 70%, et répétez ce processus de gommage trois fois pour la désinfection de la peau. Administrer la bupivacaïne (2 mg/kg, diluée dans une solution saline n’excédant pas 0,5 mL) par voie sous-cutanée sur la ligne médiane du cou, en ciblant la couche la plus superficielle. Faites une incision médiane de 3 cm à travers la peau et le fascia cervical superficiel pour exposer les muscles sternohyoïdiens et sterno-cléido-mastoïdiens (figure 5B).REMARQUE : Une lunette de dissection est suggérée. Élevez le sterno-cléido-mastoïdien à l’aide d’une dissection contondante douce à l’aide d’une sonde et rétractez-le latéralement à l’aide d’une boucle vasculaire (Figure 5C). Libérez et rétractez doucement l’omohyoid. Ensuite, libérez doucement et rétractez médialement le nerf vague et le faisceau carotidien sous le muscle omohyoïdien.REMARQUE : La principale discrimination ici est entre le nerf vague et le nerf phrénique. Coupez l’omohyoïde s’il est nécessaire d’exposer les structures sous-jacentes. Isolez le nerf phrénique (Figure 5D).REMARQUE : Le nerf phrénique longe la surface du muscle scalène antérieur, sous la forme d’un nerf longitudinal particulièrement petit traversant perpendiculairement au plexus brachial. Contrairement au nerf sciatique, l’anatomie autour du nerf phrénique au niveau du cou est plus complexe. Effectuer une confirmation électrophysiologique (étape 4.7) avant l’implantation pour de meilleurs résultats. Placez l’électrode enregistreuse par voie sous-cutanée, juste caudalement par rapport à la cage thoracique, ipsilatéralement par rapport au nerf phrénique isolé (Figure 5E). Placez les stimulateurs sur le nerf phrénique et confirmez via une signalisation synchrone (Figure 6).REMARQUE : L’évocation d’une réponse maximale avec une intensité de stimulus de ~3-6 mA et une durée de stimulus de 0,02 ms est typique. Vérifier la transsection complète du nerf phrénique en montrant l’abolition complète de la réponse évoquée lorsqu’un stimulus électrique est appliqué sur l’extrémité nerveuse proximale par rapport au site de la transection (Figure 6). Implanter un dispositif sans fil et sans pile sur le nerf phrénique (Figure 5F) en plaçant la bobine réceptrice du dispositif implantable sur le sternohyoïde, en profondeur par rapport aux muscles sterno-cléido-mastoïdiens bilatéraux, avec le brassard autour du nerf phrénique et les électrodes de contact positionnées perpendiculairement au nerf. Fermez le fascia cervical superficiel avec des sutures résorbables simples (Figure 5G). Fermez la peau avec des sutures résorbables inversées interrompues dans le derme profond. Ne remettez les animaux dans leurs cages d’origine qu’une fois qu’ils se sont complètement remis de l’anesthésie. Pour le traitement post-chirurgical, suivez l’étape 3.10. 5. Diffusion sans fil de la stimulation électrique thérapeutique Appliquer une stimulation électrique pendant 1 h aux rats sous anesthésie générale. Pour la stimulation sans fil, placez un générateur de forme/fonction d’onde (tension : 1-15 Vpp) et un amplificateur optionnel au-dessus de l’animal pour fournir une alimentation électrique à une bobine inductive externe (c’est-à-dire une bobine de transmission) (bobine spirale bidimensionnelle à 5 tours ; diamètre : 2 cm) pour assurer un bon couplage inductif avec la bobine réceptrice implantée. Délivrent des impulsions monophasiques de 200 μs à 20 Hz pendant une durée de 1 h. Pour vérifier et quantifier l’administration de la stimulation électrique, enregistrez les CMAP du muscle tibial antérieur, en ajustant la tension de stimulation pour fournir une activation supramaximale du nerf sciatique. Utilisez des électrodes à aiguille concentriques pour tous les enregistrements.REMARQUE : Si la tension maximale générée par la fonction est insuffisante pour provoquer une réponse maximale, utilisez un amplificateur. 6. L’euthanasie Méthode primairePlacez la cage sous une chambre de distribution de CO2 , réglée sur un débit de 8 à 12 LPM (ou un débit approprié en fonction de la taille de la chambre). Surveillez l’inconscience des rats, puis pendant au moins 1 minute d’arrêt de la respiration. Méthode secondaireEffectuer une luxation cervicale ou une thoracotomie bilatérale.