Измерение способности митохондрий скелетных мышц импортировать белок

Митохондрии — это органеллы, которые существуют в сложных морфологиях в различных типах клеток и, как признано, обладают растущим набором функций, которые имеют решающее значение для здоровья клеток. Как таковые, они больше не могут быть сведены только к органеллам, производящим энергию. Митохондрии являются ключевыми метаболическими регуляторами, детерминантами судьбы клеток и сигнальными центрами, функции которых могут служить полезными индикаторами общего клеточного здоровья. В клетках скелетных мышц исследования электронной микроскопии показывают наличие географически различных субсарколеммальных (SS) и межмиофибриллярных (IMF) митохондрий, которые демонстрируют степень ^{связности1,2,3,4}, которая в настоящее время признана очень динамичной и адаптируемой к изменениям в уровнях активности скелетных мышц, а также с возрастом и болезнями. Содержание и функция митохондрий в мышцах могут быть оценены различными ^{способами5,6}, и традиционные методы выделения органелл были применены для лучшего понимания дыхательных и ферментативных возможностей (Vmax) митохондрий, отличных от влияния клеточной ^{среды7,8}. В частности, эти традиционные методы выявили тонкие биохимические различия между митохондриями, выделенными из субсарколеммальных и межмиофибриллярных областей, опровергая возможные функциональные последствия для метаболизма в этих субклеточных областях8,9,10,11.

Биогенез митохондрий уникален тем, что требует вклада генных продуктов как из ядерной, так и из митохондриальной ДНК. Однако подавляющее большинство из них получено из ядра, поскольку транскрипция мтДНК приводит только к синтезу 13 белков. Поскольку митохондрии обычно содержат >1000 белков, участвующих в различных метаболических путях, биогенез органеллы требует жестко регулируемых средств импорта и сборки белков-предшественников из цитозола в различные митохондриальные подкомпоненты для поддержания надлежащей стехиометрии и ^{функции12,13}. Ядерно-кодированные белки, предназначенные для митохондрий, обычно несут митохондриальную целевую последовательность (MTS), которая нацеливает их на органеллу и облегчает их субкомпарментальную локализацию. Большинство связанных с матрицей белков содержат расщепляемый N-концевой MTS, в то время как те, которые предназначены для внешней или внутренней митохондриальной мембраны, обычно имеют внутренние целевые ^{домены14}. Процесс импорта осуществляется по набору разнообразных каналов, которые обеспечивают несколько путей для входа в ^{органеллу13}. Транслоказ комплекса наружной мембраны (TOM) переносит предшественников из цитозола в межмембранное пространство, где они распознаются транслоказой комплекса внутренней мембраны (TIM). Этот комплекс отвечает за импорт ядерно-кодированных прекурсоров в матрицу, где протеазы расщепляют N-концевую целевую пресеквацию. Белки, предназначенные для внешней мембраны, могут быть непосредственно вставлены в эту мембрану через комплекс TOM, в то время как те, которые предназначены для внутренней мембраны, вставляются белком TIM, в частности TIM22. После их импорта белки дополнительно обрабатываются резидентными протеазами и шаперонами и часто объединяются, образуя более крупные комплексы, такие как те, которые обнаружены в цепи переноса электронов.

Сам импорт митохондриального белка также служит измерением здоровья митохондрий, так как этот процесс опирается на наличие мембранного потенциала и источника энергии в виде ^АТФ15. Например, когда мембранный потенциал рассеивается, протеинкиназа PINK1 не может быть поглощена органеллой, и это приводит к сигналам фосфорилирования, которые вызывают начало деградации органеллы через путь, называемый митофагией16,17. При аналогичных обстоятельствах, когда импорт затруднен, белок ATF5 не может попасть в органеллу, и впоследствии он перемещается в ядро, где он служит фактором транскрипции для повышения регуляции экспрессии гена ^УПО18,19. Таким образом, измерение эффективности импорта белка может обеспечить всестороннее понимание здоровья органеллы, в то время как реакция экспрессии генов может быть использована для указания степени ретроградной передачи сигналов в ядро.

Несмотря на его очевидную важность для биогенеза митохондрий и для клеточного здоровья в целом, путь импорта в митохондриях млекопитающих удивительно недостаточно изучен. В этом отчете мы описываем конкретные шаги, связанные с измерением импорта белков-предшественников в митохондрии скелетных мышц, и предоставляем данные, иллюстрирующие адаптивную реакцию системы импорта на изменения в мышцах и неиспользование, иллюстрируя вклад импорта белка в адаптивную пластичность скелетных мышц.