Messung der Proteinimportkapazität der Mitochondrien der Skelettmuskulatur

Mitochondrien sind Organellen, die in komplexen Morphologien in verschiedenen Zelltypen vorkommen und eine zunehmende Anzahl von Funktionen besitzen, die für die Zellgesundheit entscheidend sind. Als solche können sie nicht mehr nur auf energieerzeugende Organellen reduziert werden. Mitochondrien sind wichtige Stoffwechselregulatoren, Determinanten des Zellschicksals und Signalknotenpunkte, deren Funktionen als nützliche Indikatoren für die allgemeine Zellgesundheit dienen können. In Skelettmuskelzellen zeigen elektronenmikroskopische Studien das Vorhandensein von geografisch unterschiedlichen subsarkoplemen (SS) und intermyofibrillaren (IMF) Mitochondrien, die einen Grad an Konnektivität aufweisen1,2,3,4, der heute als hochdynamisch und anpassungsfähig an Veränderungen der Skelettmuskelaktivität sowie mit Alter und Krankheit anerkannt ist. Mitochondrialer Gehalt und Funktion im Muskel können auf vielfältige Weise beurteilt ^werden5,6, und traditionelle Methoden der Organellenisolierung wurden angewendet, um die respiratorischen und enzymatischen Kapazitäten (Vmax) der Mitochondrien besser zu verstehen, die sich vom Einfluss des zellulären Milieus ^{unterscheiden7,8}. Insbesondere haben diese traditionellen Methoden subtile biochemische Unterschiede zwischen Mitochondrien aufgedeckt, die aus subsarkoplemalen und intermyofibrillären Regionen isoliert wurden, was mögliche funktionelle Auswirkungen auf den Stoffwechsel in diesen subzellulären Regionen widerlegt8,9,10,11.

Die Biogenese der Mitochondrien ist einzigartig, da sie den Beitrag von Genprodukten sowohl aus der kernigen als auch aus der mitochondrialen DNA erfordert. Die überwiegende Mehrheit davon stammt jedoch aus dem Zellkern, da die mtDNA-Transkription nur zur Synthese von 13 Proteinen führt. Da Mitochondrien normalerweise >1000 Proteine umfassen, die an verschiedenen Stoffwechselwegen beteiligt sind, erfordert die Biogenese der Organelle ein streng reguliertes Mittel zum Import und Zusammenbau von Vorläuferproteinen aus dem Zytosol in die verschiedenen mitochondrialen Unterkompartimente, um eine ordnungsgemäße Stöchiometrie und Funktion ^{aufrechtzuerhalten12,13}. Kernkodierte Proteine, die für Mitochondrien bestimmt sind, tragen normalerweise eine mitochondriale Zielsequenz (MTS), die sie auf die Organelle abstößt und ihre subkompartimentale Lokalisierung erleichtert. Die meisten matrixgebundenen Proteine enthalten ein spaltbares N-terminales MTS, während diejenigen, die für die äußere oder innere mitochondriale Membran bestimmt sind, normalerweise interne Zieldomänen ^haben14. Der Importprozess wird von einer Reihe verschiedener Kanäle durchgeführt, die mehrere Wege für den Eintritt in die ^Organelle13 bieten. Der Translokase-Komplex der äußeren Membran (TOM) transportiert Vorläufer aus dem Zytosol in den Intermembranraum, wo sie vom Translocase-Komplex der inneren Membran (TIM) erkannt werden. Dieser Komplex ist verantwortlich für den Import von kernkodierten Vorläufern in die Matrix, wo Proteasen die N-terminale Zielvorsequenz spalten. Proteine, die für die äußere Membran bestimmt sind, können durch den TOM-Komplex direkt in diese Membran eingefügt werden, während diejenigen, die für die innere Membran bestimmt sind, durch ein TIM-Protein, speziell TIM22, eingefügt werden. Nach ihrem Import werden Proteine von residenten Proteasen und Chaperonen weiterverarbeitet und verbinden sich oft zu größeren Komplexen, wie sie in der Elektronentransportkette vorkommen.

Der mitochondriale Proteinimport selbst dient auch als Messung der mitochondrialen Gesundheit, da dieser Prozess auf dem Vorhandensein von Membranpotential und einer Energiequelle in Form von ^ATP15 beruht. Wenn beispielsweise das Membranpotential dissipiert wird, kann die Proteinkinase PINK1 nicht von der Organelle aufgenommen werden, und dies führt zu Phosphorylierungssignalen, die den Beginn des Abbaus der Organelle über einen Weg namens Mitophagie ^{auslösen16,17}. Unter ähnlichen Umständen kann das Protein ATF5, wenn der Import behindert wird, nicht in die Organelle gelangen und transloziert anschließend in den Zellkern, wo es als Transkriptionsfaktor für die Hochregulierung der UPR-Genexpression ^dient18,19. So kann die Messung der Proteinimporteffizienz einen umfassenden Einblick in die Gesundheit der Organelle geben, während die Genexpressionsantwort verwendet werden kann, um den Grad der retrograden Signalübertragung an den Zellkern anzuzeigen.

Trotz seiner offensichtlichen Bedeutung für die Biogenese der Mitochondrien und für die Zellgesundheit im Allgemeinen ist der Importweg in den Mitochondrien von Säugetieren bemerkenswert wenig erforscht. In diesem Bericht beschreiben wir die spezifischen Schritte zur Messung des Imports von Vorläuferproteinen in die Mitochondrien der Skelettmuskulatur und liefern Daten, um die adaptive Reaktion des Importsystems auf Muskelveränderungen und Nichtgebrauch zu veranschaulichen und den Beitrag des Proteinimports zur adaptiven Plastizität der Skelettmuskulatur zu veranschaulichen.