Medición de la capacidad de importación de proteínas de las mitocondrias del músculo esquelético

Las mitocondrias son orgánulos que existen en morfologías complejas en diferentes tipos de células y se reconoce que poseen una gama cada vez mayor de funciones que son críticas para la salud celular. Como tales, ya no pueden reducirse simplemente a orgánulos productores de energía. Las mitocondrias son reguladores metabólicos clave, determinantes del destino celular y centros de señalización, cuyas funciones pueden servir como indicadores útiles de la salud celular en general. En las células musculares esqueléticas, los estudios de microscopía electrónica revelan la presencia de mitocondrias subsarcolemmales (SS) e intermiofibrilares (IMF) geográficamente distintas, que exhiben un grado de conectividad1,2,3,4 que ahora se reconoce que es altamente dinámico y adaptable a los cambios en los niveles de actividad del músculo esquelético, así como con la edad y la enfermedad. El contenido mitocondrial y la función en el músculo pueden evaluarse de numerosas ^maneras5,6, y se han aplicado métodos tradicionales de aislamiento de orgánulos para comprender mejor las capacidades respiratorias y enzimáticas (Vmax) de las mitocondrias distintas de la influencia del medio ^celular7,8. En particular, estos métodos tradicionales han revelado sutiles distinciones bioquímicas entre mitocondrias aisladas de regiones subsarcolemmales e intermiofibrilares, desmintiendo posibles implicaciones funcionales para el metabolismo en estas regiones subcelulares8,9,10,11.

La biogénesis de las mitocondrias es única en requerir la contribución de productos genéticos del ADN nuclear y mitocondrial. Sin embargo, la gran mayoría de estos se derivan del núcleo, ya que la transcripción del ADNmt solo conduce a la síntesis de 13 proteínas. Dado que las mitocondrias normalmente comprenden >1000 proteínas involucradas en diversas vías metabólicas, la biogénesis del orgánulo requiere un medio estrechamente regulado de importación y ensamblaje de proteínas precursoras del citosol en los diversos subcompartimentos mitocondriales para mantener una estequiometría y función ^{adecuadas12,13}. Las proteínas codificadas nuclearmente destinadas a las mitocondrias normalmente llevan una secuencia de orientación mitocondrial (MTS) que las dirige al orgánulo y facilita su localización subcompartimental. La mayoría de las proteínas unidas a la matriz contienen un MTS N-terminal escindible, mientras que las destinadas a la membrana mitocondrial externa o interna suelen tener dominios de orientación ^internos14. El proceso de importación se lleva a cabo mediante un conjunto de canales diversos que proporcionan múltiples vías de entrada en el ^orgánulo13. La translocasa del complejo de membrana externa (TOM) transporta precursores desde el citosol hacia el espacio intermembrana, donde son reconocidos por la translocasa del complejo de membrana interna (TIM). Este complejo es responsable de importar precursores codificados nuclearmente a la matriz, donde las proteasas escinden la presecuencia de apuntamiento N-terminal. Las proteínas destinadas a la membrana externa se pueden insertar directamente en esta membrana a través del complejo TOM, mientras que las destinadas a la membrana interna se insertan mediante una proteína TIM, específicamente TIM22. Después de su importación, las proteínas son procesadas por proteasas y chaperonas residentes y, a menudo, se combinan para formar complejos más grandes, como los que se encuentran en la cadena de transporte de electrones.

La importación de proteínas mitocondriales en sí misma también sirve como una medida de la salud mitocondrial, ya que este proceso se basa en la presencia de potencial de membrana y una fuente de energía en forma de ^ATP15. Por ejemplo, cuando el potencial de membrana se disipa, la proteína quinasa PINK1 no puede ser absorbida por el orgánulo, y esto conduce a señales de fosforilación que desencadenan el inicio de la degradación del orgánulo a través de una vía llamada ^{mitofagia16,17}. En circunstancias similares, cuando se impide la importación, la proteína ATF5 no puede entrar en el orgánulo, y posteriormente se transloca al núcleo, donde sirve como factor de transcripción para la regulación ascendente de la expresión génica ^UPR18,19. Por lo tanto, medir la eficiencia de la importación de proteínas puede proporcionar una visión completa de la salud del orgánulo, mientras que la respuesta de expresión génica se puede utilizar para indicar el grado de señalización retrógrada al núcleo.

A pesar de su obvia importancia para la biogénesis de las mitocondrias y para la salud celular en general, la vía de importación en las mitocondrias de los mamíferos está notablemente poco estudiada. En este informe, describimos los pasos específicos involucrados en la medición de la importación de proteínas precursoras en las mitocondrias del músculo esquelético y proporcionamos datos para ilustrar la respuesta adaptativa del sistema de importación a los cambios en el músculo y el desuso, ilustrando la contribución de la importación de proteínas a la plasticidad adaptativa del músculo esquelético.