骨骼肌线粒体蛋白质导入能力的测定

线粒体是存在于不同细胞类型复杂形态中的细胞器，并且被认为具有对细胞健康至关重要的越来越多的功能。因此，它们不能再仅仅被削减为产生能量的细胞器。线粒体是关键的代谢调节因子，细胞命运的决定因素和信号传导中枢，其功能可以作为整体细胞健康的有用指标。在骨骼肌细胞中，电子显微镜研究揭示了地理上不同的构体下（SS）和肌原纤维间（IMF）线粒体的存在，它们表现出一定程度的连接^性1，2，^3，4现在被认为是高度动态的，并且能够适应骨骼肌活动水平的变化，以及年龄和疾病。可以通过多种方式评估肌肉中的线粒体含量和功能^5，6，并且已经应用了传统的细胞器分离方法来更好地了解线粒体的呼吸和酶促能力（Vmax），这与细胞环境的影响不同^7，8。特别是，这些传统方法揭示了从构肌下和肌原纤维间区域分离的线粒体之间的微妙生化差异，掩盖了这些亚细胞区域代谢的可能功能意义^{8，9，10，11}。

线粒体的生物发生是独特的，需要来自核和线粒体DNA的基因产物的贡献。然而，其中绝大多数来自细胞核，因为mtDNA转录仅导致13种蛋白质的合成。由于线粒体通常由参与不同代谢途径的>1000蛋白组成，因此细胞器的生物发生需要严格调节的方式将前体蛋白从细胞质基质导入和组装到各种线粒体亚室中，以维持适当的化学计量学和功能^12，13。用于线粒体的核编码蛋白通常携带线粒体靶向序列（MTS），该序列将它们靶向细胞器并促进其亚区室定位。大多数基质结合蛋白含有可切割的N末端MTS，而那些发往线粒体膜外或内侧的蛋白通常具有内部靶向结构域¹⁴。导入过程由一组不同的通道进行，这些通道为进入细胞器提供了多种途径¹³。外膜（TOM）复合物的转座将前体从细胞质基质运送到膜间空间，在那里它们被内膜（TIM）复合物的转座体识别。该复合物负责将核编码的前体导入基质中，其中蛋白酶切割N端靶向预序列。发往外膜的蛋白质可以通过TOM复合物直接插入该膜中，而那些发往内膜的蛋白质则由TIM蛋白插入，特别是TIM22。在导入之后，蛋白质由常驻蛋白酶和伴侣进一步处理，并且通常结合形成更大的复合物，例如在电子传递链中发现的复合物。

线粒体蛋白导入本身也可以作为线粒体健康的测量，因为该过程依赖于膜电位的存在和^ATP15形式的能量来源。例如，当膜电位消散时，蛋白激酶PINK1不能被细胞器吸收，这导致磷酸化信号，通过称为线粒体自噬的途径触发细胞器降解的开始^16，17。在类似情况下，当导入受阻时，蛋白质ATF5不能进入细胞器，随后易位到细胞核，在那里它作为UPR基因表达上调的转录因子^18，19。因此，测量蛋白质导入效率可以提供对细胞器健康状况的全面洞察，而基因表达响应可用于指示向细胞核的逆行信号传导的程度。

尽管它对线粒体的生物发生和一般的细胞健康具有明显的重要性，但哺乳动物线粒体的导入途径研究不足。在本报告中，我们描述了测量前体蛋白导入骨骼肌线粒体所涉及的具体步骤，并提供数据来说明导入系统对肌肉变化和废弃的适应性反应，说明蛋白质导入对骨骼肌适应性可塑性的贡献。