共焦点顕微鏡と超解像顕微鏡の組み合わせによるマウスの神経筋接合部のキャラクタリゼーション

マウスの世話と操作は、動物実験に関する国内およびヨーロッパの法律に従って行われ、制度倫理委員会によって承認されました。 Smn2B/- (C57Bl/6Jバックグラウンド)および ColQDex2/Dex2 (B6D2F1/Jバックグラウンド)マウスのそれぞれ3週齢および6週齢の雄および雌を試験に使用した。 1.マウスの安楽死と筋肉の解剖: 前脛骨筋と腓腹筋 子宮頸部脱臼による安楽死の前に、ケタミン(87.5 mg / kg)/キシラジン(12.5 mg / kg)混合溶液(0.1 mL / 20 g体重)の腹腔内注射によるマウス麻酔に進みます。.注:SMAおよびColQ-CMSは性別とは無関係に個体に影響を与えるため、本プロトコルでは雄および雌マウスを使用した。 小さな電気シェーバーを使用して後肢の毛を取り除き、70%エタノールで脚を洗い流します。注意: 解剖手順は筋肉ごとに異なります。 前脛骨筋 (TA)の解剖は手順1.2.1〜1.2.3に従い、 腓腹筋 (GA)(内側および外側部分)の解剖は手順1.2.4〜1.2.6に従います。筋肉をやさしく扱い、解剖中の組織の損傷や押しつぶしや伸張を防ぎます。マウスを仰臥位に置きます。 筋肉を露出させるために、遠位後肢の前外側部分に沿って鋭利な鈍いハサミで5mmの皮膚切開を行います。極薄のハサミを使用して筋膜を取り除きます。 極細のハサミと湾曲した細い鉗子を使用して、最初に遠位腱(足の近く)を切り、次に近位腱(膝の近く)を切ります。筋線維や神経への損傷を避けるために、筋肉を慎重に取り扱ってください。注:筋肉全体を採取するには、近位腱を骨のできるだけ近くに切片化する必要があります。 マウスを腹臥位に置き、鋭利な鈍いハサミを使用して、遠位後肢後部コンパートメントの上部から足まで皮膚を切開し、皮膚を取り除きます。 中程度の鋸歯状の鉗子でアキレス腱をつかみ、極薄のハサミで切断し、GAを周囲の組織から近位挿入まで静かに分離します。 近位側では、中鋸歯状の鉗子を大腿二頭筋(BF)とGAの間に形成されたポケットに挿入します。 2つの筋肉を分離して、極細のハサミでGA腱を骨挿入のできるだけ近くで切断します。 組織固定のために、各筋肉をリン酸緩衝生理食塩水(Ca2 + Mg 2+を含まないPBS)で希釈した1mLの4%w / vパラホルムアルデヒド(PFA)溶液を含む2mLの微量遠心チューブに入れ、4°Cで18〜24時間保ちます。注意: パラホルムアルデヒドとホルムアルデヒドは有毒であり、適切な保護具を備えた化学ヒュームフードで取り扱う必要があります。 翌日、化学ヒュームフード内で室温(RT)で穏やかに振って、12ウェルプレートのPBSで固定筋肉を3回5分間洗浄します。注: プロトコルはこの手順で停止し、1 か月以内に続行できます。この場合、0.01%アジ化ナトリウムを添加したPBSを加えてサンプルを4°Cで保存します。 2つの細かい鋸歯状の鉗子を使用して、幅約1 mmの小さな繊維束で各筋肉をいじります。注意: からかい中の組織の損傷を防ぐために、過度の力をかけずに鉗子で筋肉を非常に穏やかに操作することが重要です。TA筋肉をそのサイズに応じて3つまたは4つの束に解離します。 GAの場合、筋肉の内側部分と外側部分を分離し、サイズに応じて各部分を4〜5個の束に解離します。 2.免疫染色 筋繊維透過処理の進行:PBS中の1%(v/v)Triton X-100を含む24ウェルプレートに筋束を移し、室温で1時間、または4°Cで5時間、穏やかな攪拌(50 rpm)下に保ちます。注:筋肉束を2つのプレートに分割して、別々の免疫染色を進め、抗体の混乱のリスクを最小限に抑えます。それらを2つ以上のウェル(1ウェル/プレート)に分割しないでください。そうでなければ、分析された筋肉におけるそれらの一般的な状態を表すNMJの数(N)は不十分である可能性がある。 サンプルをRTでPBSで3回5分間洗浄し、PBS/Triton X-100 1%中の4%ウシ血清アルブミン(BSA)からなるブロッキング溶液で、穏やかな攪拌(50 rpm)下で4°Cで4時間インキュベートします。注意: 洗浄ステップでは吸引ポンプを使用せず、200 μLのピペットと小型のチップを使用して手動で溶液を吸引してください(参照は 材料の表に示されています)。 ニューロフィラメントM(NF-M、2H3、希釈1/200)またはシナプス小胞糖タンパク質2(SV2、希釈1/200)のいずれかに対する一次モノクローナル抗体を含むステップ2.2で示されるブロッキング溶液を使用して、サンプルを穏やかな攪拌(50 rpm)で4°Cで一晩(O/N)インキュベートし、シナプス前軸索末端または活性ゾーンをそれぞれ標識します。 翌日、筋肉束を攪拌(50 rpm)しながらPBSで5分間3回洗浄します。共焦点イメージングの場合:赤色発光蛍光色素(F594)(希釈率1/500)を結合させた二次抗マウス抗体と、緑色発光蛍光色素(α-BTX-F488)を結合させたα-ブンガロトキシン(希釈率1/1000)をPBS中でRT攪拌(50 rpm)下で2時間インキュベートします。 STEDイメージングの場合:緑色発光蛍光色素(F488)(希釈率1/500)と結合したα-ブンガロトキシンをPBS中で高い光安定性(α-BTX-F633)(希釈1/1000)と結合させた二次抗マウス抗体を、撹拌下(50 rpm)でRTで2時間インキュベートします。注意: 光退色を避けるために、インキュベーション中にサンプルを光にさらさないでください。 ラベルを付けた筋肉束を攪拌(50 rpm)しながらPBSで5分間3回洗浄し、封入剤を入れたスライドに置きます。注意: シールできるように、スライドごとに最大4〜5個の筋肉束を配置します。 上部にグレード#1.5(または#1.5H)のガラスカバースリップ(厚さ0.17 mm)を追加し、スライドの両側に円筒形の磁石を置いて圧力をかけ、筋肉を平らにします。 スライドを4°Cの軽いO / Nから保護してください。 スライドをマニキュアで永久に密封します。 3. 画像取得 共焦点顕微鏡による取得注:画像は、63倍の大きさの油浸対物レンズ(HCX Plan Apo CS、1.4開口数(NA))を使用して、倒立レーザー走査型共焦点顕微鏡で収集されました。盲検分析の場合は、分析に関与していない人に、指定された番号の各スライドをコーディングさせます。すべてのサンプルについてNMJパラメータの定量が完了するまで、実験群を盲検のままにします。 顕微鏡ソフトウェアをmachine.xlhw>コンフィギュレーションモードで起動します(補足図1)。 スライドを顕微鏡ステージに置き、DAPIフィルターセットを使用してDAPI広視野蛍光照明の下を見て、サンプル内の観察面を見つけます。 [ プロジェクトを開く] > [新しいプロジェクト] をクリックし、画像取得を保存するフォルダーを作成します (補足図 1)。注: NMJごとに新しいプロジェクトを作成して、フォルダサイズを制限し、コンピュータのメモリの問題を防ぎます。 取得パラメータを管理するには、[ 取得 ]タブウィンドウをクリックし、共焦点ピンホールを1.0エアリーユニットとレーザー出力に設定して、イメージングする必要があるエンドプレートで488 nmレーザーを使用して、緑色/F488(α-BTX)蛍光のゲインとオフセットレベルを最適化します(ライブモードオン)。 次に、F594観察に適合したレーザーを使用して、赤色/F594(NF-MまたはSV2)蛍光取得を最適化します。この研究では、552 nmレーザーを使用しました(ライブモード オン)。各レーザーに次の範囲で色素発光のスペクトルを設定します:414〜483 nmのレーザー405(DAPI)、506〜531 nmのレーザー488(F488-α-BTX)、および622〜650 nmのレーザー552(NF-M / SV2)。 400 Hzサンプリングレートで画像サイズ1024 x 1024ピクセル(73.7 x 73.7 μm)、双方向X ON、ズーム係数2.5、ZワイドモードでZステップサイズ0.5 μmの画像サイズを同じ設定で各実験グループの神経筋接合部の画像スタックを収集します。注: NMJごとに、スライスの数が設定され、ジャンクション全体が集録されます。上記の取得設定は、ナイキスト・シャノンサンプリング定理を満たします。ただし、最近のすべての共焦点オペレーティング・ソフトウェアにある 「フォーマットの最適化 」ボタンをクリックして、ピクセル・サイズとZステップが理想的なナイキスト・サンプリング・レートを満たすようにすることができます。このアクションにより、体積測定の精度が低下する原因となる画像のオーバーサンプリングまたはアンダーサンプリングを回避できます。 元のファイル(.lif)またはZスタック画像(.tif)を、スライドのコード名、染色タイプ、エンドプレート番号を含む名前のフォルダーに保存します。注意: 488 nmおよび552 nmレーザー(F488およびF594)を使用してスキャンを順番に(同時にではなく)収集して、F488蛍光がF594チャネルに、またはその逆(ブリードスルー)のクロストークを回避します。注意:ビームパスは、顕微鏡ソフトウェアのDyeアシスタントを使用して構成できます。 次のコード化されたスライドに変更し、NMJごとに手順3.1.3-3.1.8を繰り返します。 セッションの最後に、 3Dビューアで開く をクリックし、実験グループのNMJ代表を選択して3Dラベリングを視覚化します。注:この表示モードは、取得パラメータが正しいことを確認するのに役立ちます。 顕微鏡ソフトウェアを閉じ、レンズティッシュで対物レンズを洗浄してから、システムの電源を切ります。 STED顕微鏡による取得注:画像は、100倍の油浸対物レンズ(HC PL APO CS2 1.4 NA)を使用して、775 nmのゲート付きSTEDを備えた倒立レーザー走査型共焦点顕微鏡で収集されました。盲検分析の場合は、分析に関与していない人に、指定された番号の各スライドをコーディングさせます。すべてのサンプルについてNMJパラメータの定量が完了するまで、実験群を盲検のままにします。 顕微鏡ソフトウェアを コンフィギュレーションモードで起動し> machine.xlhw とSTED をオンにします (補足図2)。 [ プロジェクトを開く] > [新しいプロジェクト ] をクリックして、画像取り込みを保存するフォルダーを作成します。注: スライドごとに新しいフォルダを生成して、フォルダのサイズを制限し、コンピュータのメモリの問題を防止します。 スライドを顕微鏡ステージに置き、488 nmレーザーを使用して広視野蛍光照明下で観察し、サンプル内の観察面を見つけます。 506-531 nmのスペクトル検出を備えた488 nmレーザーを使用して、ニューロフィラメントM(NF-M)またはSV2染色で標識されたNMJを検索します。 NMJが特定されたら、[ STEDのアクティブ化 ]をクリックし、640〜750 nmのスペクトル検出を備えた635 nmレーザーを使用して、いくつかの接合部の折り目を含む領域で画像の取得を開始します(補足図3)。注意: 画像取得中は彩度ルックアップテーブルに注意し、露出オーバー(グレー値>255、8ビットの場合)を避けるために[ クイックLUT ]ボタンをクリックしてください。 400 Hzのサンプリングレートで画像サイズ2048 x 2048ピクセル(38.75 x 38.75 μm)の同じ設定で各実験グループの画像を収集します。注意: 空乏レーザー(STED)出力は65%に設定されています。 スライドのコードを含むファイル名で画像を保存します。注意: クリックすることができます 最適化されたXYフォーマット:フォーマットを設定する STED イメージングで最適な取得設定を取得します。 次のコード化されたスライドに変更し、手順 3.2.3-3.2.8 を繰り返します。すべてのスライドに対してこの手順を繰り返します。 STED 顕微鏡セッションの最後に、画像ファイルを別のコンピューターに転送し、元のファイル (.lif) を外部ドライブまたはサーバーに保存します。 顕微鏡ソフトウェアの電源を切り、レンズティッシュで対物レンズを清掃してから、システムの電源を切ります。 4.画像分析-共焦点顕微鏡 注:すべての画像は、Microsoft Windows 10プロフェッショナルオペレーティングシステムを使用するコンピューターで処理されました。 ImageJとカスタムマクロを起動して、シナプス後NMJエンドプレートボリューム、最大強度投影(MIP)領域、および相対的な曲がりを計算します。NIH ImageJフリーウェア23、iGeodesicプラグイン、およびカスタムマクロを使用してNMJ画像スタックを処理し、NMJパラメータ測定値を取得します。ImageJソフトウェアを起動します。注:ImageJの最新バージョンは無料で入手でき、ダウンロードできます24。独自のファイル形式を開くには、Bio-Formatsパッケージ25 プラグインをダウンロードする必要があります26 。プラグインはすでにソフトウェアにインストールされているため、オペレーターがフィジーを使用する場合、この手順は必要ありません。曲がりくねりを計算するためのiGeodesicプラグイン27 は、オンラインでも利用できます28;使用されるImageJ/Fijiバージョンでこのプラグインが使用可能であることを確認してください。カスタムメイドのマクロはオンラインでも入手できます29。 Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal.ijm (カスタムメイド、補足コーディングファイル1) を ImageJ ウィンドウにドラッグアンドドロップします。マクロは 2 番目のウィンドウで開きます。この新しいウィンドウで、[マクロ]をクリックして[マクロを実行]>をクリックします。注 : マクロは、専有ファイルと TIFF ファイルの両方を処理できます。ファイルは次の基準を満たす必要があります:独自のファイル形式の場合、ファイルごとに1つのジャンクション(つまり、画像のスタック)のみをフォルダーに保存します。TIFF イメージの場合、ファイルは、特定のジャンクション (RGB TIFF) のイメージ スタックと共に 、それぞれ JunctionX (X は NMJ 番号に対応) という名前のサブフォルダーを含むフォルダーに保存する必要があります (補足図 4)。 分析する必要がある Junction サブフォルダーを含むネイティブ フォルダーを選択し、[ 選択] をクリックします。 [フォルダの保存]という新しいポップアップメニューで、ストレージフォルダを選択し、[選択]をクリックします。 「 画像タイプ」という新しいポップアップメニューで、Z スタック取り込みのフォーマットを選択します。 目的の染色に対応するRGBチャンネルを選択し、XYピクセルサイズとZステップ(z)を示します。マクロは自動的に分析を実行します。注: 独自のファイル形式が選択されている場合、マクロはピクセル サイズと Z ステップ (z) を直接読み取ります。ただし、ユーザーは目的のチャネル (C1、C2、または C3) を指定する必要があります。マクロは、保存フォルダ内の各ジャンクションパラメータ(エンドプレートボリューム、MIP面積、曲がりくねり)のデータシート(.csv)を提供します。このマクロでは、3 つの .TIF ファイルは、α-BTX染色 Drawing_MaxprojX.tif、 DrawingJunctionX.tif、およびMIP MaxprojX.tifの境界に対応します。これらのTIFFファイルは、取得の品質を検証し、画像処理が正しく実行されたことを確認するために生成されます。シナプス後NMJボリューム(V):マクロは単一のNMJから画像を分離し、シナプス後エンドプレートに対応するα-ブンガロトキシンF488チャネルを維持します。スタックは、スタックの中間スライスで Otsu しきい値30 を使用してセグメント化されます。結果のバイナリ画像は1ピクセル拡張され、 パーティクルの分析 機能を使用して、検出された各オブジェクトのエンドプレート領域を測定します。シナプス後NMJ体積を得るために、マクロはスタックのすべての測定された終板領域を合計し、それにμm単位のZステップ値(z)を掛けます。最大強度投影 (MIP) エンドプレート領域: スタックがしきい値に達した後、 Z プロジェクト ImageJ 機能を使用して最大強度投影 (MIP) が取得されます。次に、 パーティクルの解析 機能を使用して、MIPエンドプレート面積を定量化します。NMJ MIPの曲がり(T):折り目と穿孔31を含むシナプス後運動終板の複雑さの程度を反映するNMJの曲がりは、次の式を使用して各MIPに基づいて計算されます。 ここで、d Obj(AB)は物体の周囲に沿ったAとBの間の距離、dEuc(AB)はAとBの間のユークリッド距離(直線)。 各実験条件の野生型群における最も高い屈曲値を100%とし、相対NMJ据曲度を得るために、実験条件の他のすべての値をこの値に正規化する。 ImageJとカスタムマクロを起動して、シナプス前ニューロフィラメントの蓄積とシナプス小胞糖タンパク質2染色を定量します。注:ニューロフィラメントの蓄積(ここではNF-M)および/またはシナプス小胞の分布の変化(ここではSV2)は、異常な軸索輸送および/または小胞輸送障害のマーカーであり、さまざまなSMAマウスモデルのNMJで以前に観察されました32,33,34。Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal.ijm (カスタムメイド、補足コーディングファイル2) を ImageJ ウィンドウにドラッグアンドドロップします。マクロが 2 番目のウィンドウで開きます。この新しいウィンドウで、[マクロ]をクリックして[マクロを実行]>をクリックします。注 : このマクロは、独自のファイル形式と TIFF ファイルの両方を処理できます。ファイルは、以下の手順4.1.2のNOTEに示されている基準を満たしている必要があります。 分析する必要がある Junction サブフォルダーを含むネイティブ フォルダーを選択し、[ 選択] をクリックします。 [フォルダの保存]という新しいポップアップメニューで、ストレージフォルダを選択し、[選択]をクリックします。 「 画像タイプ」という新しいポップアップメニューで、Z スタック取り込みのフォーマットを選択します。 染色情報ポップアップで、シナプス前およびシナプス後のラベルと色を指定し、[OK]をクリックします。たとえば、シナプス前ラベル:SV2またはNF、シナプス前色:R、シナプス後ラベル:BTX、シナプス後色:G。注:独自のファイル形式の場合、ラベルと対応するチャネル(C1、C2、またはC3)を示す必要があります。 [ピクセル サイズ] ポップアップで、XY ピクセル サイズ 0.072 μm と Z ステップ 0.5 μm (z) を指定し、[ OK] をクリックします。マクロは自動的に分析を実行します。注:このパラメータは、共焦点顕微鏡の取得前に選択された画像サイズ1024 x 1024ピクセル(73.7 x 73.7 μm)に対応し、対物レンズとズーム設定に関連付けられています。独自のファイル形式が選択されている場合、マクロはピクセル サイズと Z ステップ (z) を直接読み取ります。マクロは、保存フォルダーに、シナプス前およびシナプス後ボリュームのデータシート(.csv)を、各(シナプス前およびシナプス後)ラベルの現在の検出の複数ページのTIFF画像に保存します。上記のように、これらのTIFFファイルは、取得の品質をチェックし、画像処理が正しく実行されたことを確認するために生成されます。このマクロは、α-ブンガロトキシン-F488標識と共局在するNF-M-F594チャネルからの軸索ニューロフィラメントM染色の体積(NF体積)と、α-BTX-F488標識と共局在するSV2-F594チャネルからのNMJシナプス小胞糖タンパク質2染色の体積(SV2体積)を計算します。NF-M蓄積は、以下に示すように、NF体積とシナプス後終板(α-BTX)体積の比率、およびNMJ軸索終末占有率をSV2とα-BTX体積の比率で計算することによって定量化されます。 5.画像分析-STED顕微鏡 注:画像処理は、STED顕微鏡メーカーのオフラインソフトウェアで実行しました。 顕微鏡ソフトウェアを起動します。 [ プロジェクトを開く ] ボタンをクリックしてプロジェクトを開きます。プロジェクト ファイル (.lif) を選択して開きます。画像は名前とともに画面に表示されます。 プロセスウィンドウで:ノイズリダクション>中央値をクリックします。中央のウィンドウの下部で、[半径]を[5.00]、[反復]を[1.00]に設定し、[3Dフィルタリング]のチェックを外します。 次に、ウィンドウの左上にある[ プロジェクトを開く ]タブを選択し、画像を選択します。 [ 適用 ] をクリックして、パラメーターを検証します。”nameofimage_median001″ という新しいイメージが作成されます。注:適用する前に[プレビュー]をクリックしてメディアンフィルターの効果を監視すると、画像のコントラストが向上し、定量に使用されるラインプロファイルが滑らかになります。 手順5.4〜5.5に示すように、すべての画像にフィルターを適用します。 [ プロジェクトを開く ]タブで、フロッピードライブアイコンをクリックして、新しく作成されたフィルタリングされたイメージを含むすべてのプロジェクトを保存します。注:次の手順は、「nameofimage_median001」という名前のフィルタリングされた画像を使用して実行されます。 AChRストライプ間の距離を計算する注:接合後襞の形態の変化は、NMJ病理(未熟または変性)の兆候として神経筋障害でしばしば観察されます。α-ブンガロトキシン染色によって検出されるAChRストライプ間の距離(d)は、強度プロファイルを生成し、ラインプロファイルを描画して各最大強度ピーク間の距離を定量化することによって計算されます(補足図5)。顕微鏡ソフトウェアを使用して、中央ウィンドウの上部にある [定量] メニューを選択します。 左上の[ ツール ]タブをクリックします。左上のパネルで [強度 ]を選択し、[ ラインプロファイル ]アイコンをクリックします。 [オーバーサンプリング ] を 1 に設定し、[ チャンネルの並べ替え] にチェックマークを付けます。 [ プロジェクトを開く ]タブをクリックし、分析するフィルタリングされた画像を選択します。注意: コンピュータのマウスでスクロールすると、画像を拡大することができます。画像のダイナミックレンジは、表示された画像の横の左側のバーを使用して変更でき、ストライプの視覚化を容易にします。 次に、右側のウィンドウのトップメニューにある [線の描画 ]アイコンをクリックして、いくつかのストライプ/ジャンクションフォールドを垂直に交差する線をトレースします。注意: 強度プロファイルは中央のウィンドウに表示されます。 最初のピークの上部をクリックし、次の最大ピークに達するまでマウスの左ボタンを押したままマウスポインタを移動します。注:情報は強度プロファイルに表示され、2つのピーク間の距離はチャートの下に「dx」金種で表示されます。 右側のウィンドウの画像を表示しているときにマウスを右クリックし、[ ROIの保存]を選択します。保存したROI(関心領域)を開くには、[ ROIの読み込み]をクリックします。 右ウィンドウの左上にある矢印アイコンをクリックし、ROIをクリックして、ビンアイコンをクリックして削除します。 異なる強度プロファイルからこの操作を必要な回数だけ繰り返して、分析された筋肉のグローバル値を表すAChRストライプ距離の予測数を取得します。注:最適なN値は、グループ間の推定差、αリスク、検出力、および片側検定または両側検定に基づいて事前に計算できます。現在の実験計画では、片側マン・ホイットニー検定(αリスク= 10%、検出力= 80%)を適用し、N値は、2つの動物群を比較するために、NMJあたり少なくとも5つのAChRストライプ距離であると推定されました。 AChR ストライプ幅注:ストライプ幅(w)は、強度プロファイルの全幅半値(FWHM)に対応し、α-BTXシグナル蛍光値が最大強度の半分になるポイント間の距離です(補足図5)。顕微鏡ソフトウェアを使用して、中央のウィンドウにある 定量 メニューを選択します。 左上の[ ツール ]タブをクリックします。左上のパネルで[ 強度 ]を選択し、[ FWHMの決定 ]アイコンをクリックします。[ チャンネルを並べ替える] にチェックマークを付けます。注意: ソフトウェアによるピーク検出を最適化するために、 設定しきい値 と 幅 はそれぞれ50と3に設定されました。これらの値を実験ごとに調整し、経験豊富なイメージング科学者にアドバイスを求めてください。 [ プロジェクトを開く ]タブをクリックし、分析するフィルタリングされた画像を選択します。注意: コンピュータのマウスでスクロールすることで、右側のウィンドウに表示されている画像を拡大することができます。上記のように(ステップ5.8.3の後の注記)、最適なストライプの視覚化のために画像のダイナミックレンジを変更できます。 次に、右側のウィンドウのトップメニューにある [長方形の描画 ]アイコンをクリックします。水平または垂直のストライプを選択し、ストライプに対して垂直に長方形を描画します。中央のウィンドウにプロファイルが表示されます。 左側のパネルにある平均投影メニューの[垂直]または[水平]のいずれかをクリックし、ストライプの向きが垂直か水平かによって異なります。 中央のウィンドウで [統計 ]をクリックし、FWHM値を読み取ります。 右側のウィンドウに表示されている画像をコンピューターのマウスで右クリックし、[ ROIの保存]を選択します。注: [ROI のロード] をクリックして、保存した ROI を開きます。 右ウィンドウの左上にある矢印アイコンをクリックし、ROIをクリックして、ビンアイコンをクリックして削除します。 分析された筋肉のグローバル値を表すAChRストライプ幅の予測数を取得するまで、異なる長方形のROIから必要な回数だけこの操作を繰り返します。 6.実験計画と統計的検定 特定のソフトウェアを使用して統計分析を実行します。注:データは、共焦点顕微鏡イメージングではN≥3の生物学的反復と遺伝子型あたり少なくとも20NMJ、STEDイメージングではN≥5の生物学的反復と遺伝子型あたりN = 5NMJから収集されました。有意性は対応のないマン・ホイットニー検定(ノンパラメトリック)によって評価され、 p値は対応する図の凡例に示されています。