Bu protokol, SMA ve ColQ ile ilişkili CMS’nin fare modellerindeki patolojik değişiklikleri ölçmek için kullanılan kombine konfokal ve STED mikroskopisi ile nöromüsküler kavşakların morfometrik analizi için bir yöntemi açıklamaktadır.
Nöromüsküler kavşaklar (NMJ’ler), moleküllerin sinir sisteminden gönüllü kaslara iletilmesinde önemli bir rol oynayan ve kasılmaya yol açan alt motor nöronlar ve iskelet kası lifleri arasındaki oldukça uzmanlaşmış sinapslardır. Duchenne musküler distrofisi (DMD), konjenital miyastenik sendromlar (CMS), spinal müsküler atrofi (SMA) ve amiyotrofik lateral skleroz (ALS) gibi kalıtsal nöromüsküler bozukluklar dahil olmak üzere birçok insan hastalığında etkilenirler. Bu nedenle, nöromüsküler kavşakların morfolojisinin ve hastalık fare modellerindeki değişikliklerinin izlenmesi, patolojik çalışmalar ve terapötik yaklaşımların klinik öncesi değerlendirmesi için değerli bir araçtır. Burada, murin ile alay edilen kas liflerinden motor uç plakalarının ön ve postsinaptik kısımlarının üç boyutlu (3D) morfolojisini etiketleme ve analiz etme yöntemleri açıklanmaktadır. Konfokal görüntüleme ile numune hazırlama ve NMJ hacmi, alanı, kıvrımlılığı ve akson terminal morfolojisi/doluluğunu ölçme prosedürleri ve süper çözünürlüklü uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobu ile postsinaptik bileşke kıvrımları ile asetilkolin reseptörü (AChR) şerit genişliği arasındaki mesafe detaylandırılmıştır. Bu NMJ parametrelerindeki değişiklikler, SMA ve CMS’den etkilenen mutant farelerde gösterilmiştir.
Nöromüsküler bileşke (NMJ), bir motor akson terminali, bir perisinaptik Schwann hücresi ve kimyasal bilginin iletilmesinde ve alt motor nöron aktivitesinin kas kasılmasına bağlanmasında rol oynayan iskeletsel bir miyofiber kısmından oluşan karmaşık bir yapıdır. Memelilerde, nöromüsküler kavşağın morfolojisi gelişim sırasında değişir, olgunlaşmadan sonra tipik bir simit benzeri şekil benimser, türler arasında şekil ve karmaşıklık farklılıkları vardır ve egzersiz veya yaşlanma gibi fizyolojik süreçlere yanıt olarak bir dereceye kadar plastisite gösterir 1,2,3,4 . Postsinaptik motor uç plakası, asetilkolin reseptörleri (AChR) içeren üst kısmın presinaptik terminal akson dal5 ile yakın temas halinde olduğu bileşke kıvrımları adı verilen membran invaginasyonları oluşturur.
Nöromüsküler kavşaklardaki morfolojik ve fonksiyonel değişiklikler, spinal müsküler atrofi (SMA) ve amiyotrofik lateral skleroz (ALS), Duchenne musküler distrofisi (DMD), konjenital miyastenik sendromlar (CMS), myastenia gravis (MG) ve sentronükleer miyopatiler (CNM) gibi çeşitli nörodejeneratif hastalıkların patofizyolojisine katkıda bulunur ve yaşlanmaya bağlı sarkopeni 3,6,7,8,9, 10,11,12. Bu hastalıklarda son plaka parçalanması, postsinaptik bileşke kıvrım boyutunda azalma ve/veya denervasyon gibi NMJ yapısal değişiklikleri gözlenir. NMJ’lerin patolojisi, hastalığın ilerlemesi sırasında birincil veya erken bir olay olabilir veya klinik bulgulara katkıda bulunan ikincil bir olay olarak daha geç ortaya çıkabilir. Her durumda, bu hastalıkların hayvan modellerinde NMJ’lerin morfolojisinin izlenmesi, patolojik değişiklikleri incelemek ve potansiyel tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için değerli bir parametreyi temsil eder.
Nöromüsküler kavşakların morfolojisi genellikle konfokal mikroskopi 2,13,14,15 veya elektron mikroskobu 5,16 kullanılarak tekniklerle, sırasıyla çözünürlük veya teknik zorluklar gibi doğal sınırlamalarıyla analiz edilir. Daha yakın zamanlarda, süper-çözünürlüklü mikroskopi, elektron mikroskobu ile ultrayapısal analize alternatif veya tamamlayıcı bir yaklaşım olarak, presinaptik aktif bölgeler veya postsinaptik membran16,17,18 üzerindeki AChR dağılımı gibi NMJ’nin belirli bölgelerini görselleştirmek için de kullanılmıştır.
Bu protokol, floresan konfokal ve uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskopisini birleştirerek NMJ morfolojik parametrelerini değerlendirmek için ayrıntılı ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlamayı amaçlamaktadır. Presinaptik ve postsinaptik uç plakaların hacim, alan, göreceli kıvrımlılık, AChR şerit genişliği ve fare gastroknemius ve tibialis anteriorunun innerve alaylı kas liflerindeki akson terminal dağılımı gibi önemli özellikleri normal ve hastalıklı durumlar bağlamında ölçüldü. Özellikle, NMJ defektleri, SMN1 geni 11,19’daki mutasyonların neden olduğu motor nöron dejenerasyonu olan bir nöromüsküler hastalık olan spinal müsküler atrofinin Smn2B / – fare modelinde ve konjenital miyastenik sendrom20’nin bir modeli olarak asimetrik asetilkolinesteraz nakavtının (ColQ Dex2 / Dex2 veya ColQ-KO) kollajen benzeri bir kuyruk alt biriminde örneklendirilmiştir. 21,22.
Açıklanan video protokolü, sinaptik öncesi ve sonrası seviyelerde patolojik değişiklikleri karakterize etmek için kullanılabilecek konfokal ve STED mikroskopiyi birleştirerek nöromüsküler kavşakların 3D yapısını ölçmek için ayrıntılı bir yöntem sağlar. STED mikroskobunun yüksek çözünürlüğü, geleneksel konfokal görüntüleme ile tanımlanamayan nanoyapıların görselleştirilmesine ve morfometrik analizine izin verir. Bu prosedür, SMA ve ColQ ile ilişkili CMS farelerinin tibialis anterior ve gastroknemius olmak üzere iki apandiküler kastaki NMJ’lerin yapısal değişikliklerini ölçmemizi sağladı.
Bu teknikle güvenilir sonuçlar elde etmek için, kasları düzgün bir şekilde parçalamak ve kızdırmak, kası çevreleyen fasyaya ve kas demetlerini ayırmak için uygulanan güce özellikle dikkat etmek çok önemlidir; Aksi takdirde, innervasyon paterni bozulabilir ve uygun presinaptik NMJ değerlendirmesini engelleyebilir. NMJ’leri TA ve GA’dan analiz etmek için ayrıntılı bilgi sağlanmasına rağmen, prensip olarak, bu protokol, diyafram veya enine abdominis37 gibi düz kaslar da dahil olmak üzere diğer kaslara uyarlanabilir. Doku fiksasyonu, kaliteli boyama sağlamak için de çok önemlidir; bu nedenle, uygun bir hacimde (kasın 15-20 katı) yüksek kaliteli PFA kullanılması önerilir. Ek olarak, fiksatif maruz kalma süresi önemli bir adımdır, çünkü büzülme ve kümelenme gibi artefaktlar aşırı fiksasyon nedeniyle ortaya çıkabilir ve NMJ özelliklerini etkileyebilir. Numunelerin büyüklüğü ve paraformaldehit çözeltisinin dokulardaki penetrasyon hızı38 göz önüne alındığında, bu tip kas için 18-24 saatlik bir fiksasyon süresi önerilir. Boyama adımının doku hasadından bir haftadan fazla bir süre sonra planlanması durumunda, bakteriyel çoğalmayı önlemek için PBS’de PFA ile sabitlenmiş kasların sodyum azid ile desteklenmiş 4 ° C’de tutulması önerilir.
Bu protokol, konfokal için α-BTX-F488 ve STED görüntüleme için α-BTX-F633 kullanan bir yaklaşım sunar. Bu floroforlar, tarif edilen deneysel tasarıma uyacak şekilde seçilmiştir, ancak mevcut ekipman ve malzemelere göre değiştirilebilir. Örneğin, görüntü alma ve niceleme için STED CW 592 nm lazer kullanılırken α-BTX F488 etiketleme seçilebilir. Bununla birlikte, bu çalışmada uygulanan konfigürasyonun (darbeli uyarma kapılı STED, 775 nm tükenme) sürekli dalga STED39 gibi diğer yaklaşımlardan daha yüksek performans ve daha iyi çözünürlük sergilediği ve mevcut uygulama için daha uygun hale getirdiği görülmektedir. Özellikle STED (hem uyarma hem de tükenme) için lazer güç ayarlarının dikkatlice seçilmesi de önemlidir, çünkü bir yoğunluk profilinin özellikleri doygunluk durumunda ölçülemez ve bu nedenle bir NMJ görüntüsündeki herhangi bir doymuş sinyal tüm analizi tehlikeye atabilir.
Mikroskop yazılımı ve ImageJ makroları kullanılarak görüntü yakalama ve analiz dahil olmak üzere bu ayrıntılı iş akışı, tek bir kastan konfokal ve STED mikroskobu ile otonom NMJ morfometrik analizini kolaylaştırmak için geliştirilmiştir. NMJ-morph2 veya NMJ-Analyser14 gibi NMJ konfokal analizi için daha önce tanımlanmış iş akışları, NMJ’lerin morfolojik analizini ve karşılaştırmalı çalışmaları kolaylaştıran yarı otomatik yöntemlerin tasarımının yolunu açtı. NMJ-morph (ve güncellenmiş sürümü aNMJ-morph15), 21 morfolojik özelliği ölçmek için maksimum yoğunluk projeksiyonunu kullanan ücretsiz bir ImageJ tabanlı platformdur ve NMJ-Analyser, Python’da geliştirilen ve tüm 3D NMJ yapısından 29 ilgili parametre üreten bir komut dosyası kullanır. El ile eşikleme, kullanıcı analizi gerektiren bu iki yöntemde görüntü işleme sırasında tek adımdır. Bu entegre protokol, doku hazırlama, 3D konfokal görüntü alımları ve tüm iskelet kaslarından NMJ’lerin ImageJ tabanlı işlenmesi için adımları detaylandırır ve postsinaptik (hacim, maksimum projeksiyon alanı ve kıvrımlılık) ve presinaptik (akson terminal doluluk ve nörofilament birikimi) uç plakalarının beş önemli parametresine basitleştirilmiş bir genel bakış sağlar. Ek bir biyolojik alaka parametresi olan postsinaptik bileşke kıvrımlarının AChR organizasyon paterni, süper çözünürlüklü STED mikroskopisi (çözünürlük 20-30 nm)40 ile nano ölçekte morfometrik analiz için dahil edilmiştir. İlginçtir ki, STED görüntüleme için doku hazırlığı, NMJ ultrastrüktürel çalışmaları için kullanılan geleneksel transmisyon elektron mikroskobu (TEM)9 gibi diğer yöntemlerden daha basittir; bu, uygun kas bölgesinin ultra ince kesitlerini elde etmek için yetenekli bir manipülatör gerektiren oldukça karmaşık ve zaman alıcı bir prosedürdür. Ek olarak, çoklu bağlantı kıvrımlarından elde edilen nicel veriler, STED ile ilişkili yazılım kullanılarak otomatik olarak elde edilebilir.
Bu protokol, SMN ve ColQ eksikliği olan kaslarda20,36,41,42 daha önce bilinen NMJ defektlerini göstermek için uygulandı. İki fare modelinde konfokal mikroskopi ile postsinaptik uç plaka hacminin azalması, MIP alanı ve göreceli kıvrımlılık ve artmış nörofilament birikimi gibi yaygın değişiklikler bulunurken, bazı daha spesifik bulgular (azalmış NMJ doluluğu), bozulmuş vezikül kaçakçılığının bir göstergesi olarak sadece SMA farelerde gözlenmiştir36. Son olarak, daha önce TEM20 tarafından gözlemlendiği gibi, postsinaptik bileşke kıvrımlarındaki ultrayapısal kusurların belirtileri olan STED analizi ile ColQ-KO’da AChR şerit mesafesi ve genişliğinde bir artış tespit edildi. Önemli olarak, bu protokol gelişim, bakım sırasında ve çeşitli patolojik koşullar altında nöromüsküler kavşakların daha derinlemesine morfolojik karakterizasyonuna yardımcı olabilir.
The authors have nothing to disclose.
Genethon’un “Görüntüleme ve Sitometri Çekirdek Tesisi” nin yanı sıra kısmen Ile-de-France Bölgesi, Conseil General de l’Essonne, Evry Genopole Recherche, Evry Val d’Essonne Üniversitesi ve INSERM, Fransa’dan ekipman fonları tarafından desteklenen histoloji servisine teşekkür ederiz. Ayrıca Smn 2B/2B fare hattını (Ottawa Üniversitesi, Kanada) sağladığı için Dr. Rashmi Kothary’ye ve ColQDex2/+ fare çizgisi için Dr. Eric Krejci’ye (yayınlanmamış, Paris Üniversitesi, Fransa) minnettarız. Guillaume Corre’a istatistiksel analizdeki desteği için teşekkür ederiz. 2H3 (Jessel, TM ve Dodd, J. tarafından geliştirilmiştir) ve SV2 (Buckley, K.M. tarafından geliştirilmiştir) monoklonal antikorları, NIH’nin NICHD’si tarafından oluşturulan ve Iowa Üniversitesi, Biyoloji Bölümü, Iowa City, IA 52242’de sürdürülen Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası’ndan (DSHB) elde edilmiştir. Bu çalışma Association Française contre les Myopathies (AFM-Telethon), INSERM ve Evry Val d’Essonne Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.
Buffers and Reagents | |||
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (F488) | Life Technologies, Thermofisher | A-11001 | |
Alexa Fluor 488 α-bungarotoxin (F488-a-BTX) | Life Technologies, Thermofisher | B13422 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (F594) | Life Technologies, Thermofisher | A-11032 | |
ATTO-633 α-bungarotoxin (F633-a-BTX) | Alomone Labs | B-100-FR | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
DAPI Fluoromount-G | Southern Biotech | 00-4959-52 | |
DPBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
Ethanol Absolute | VWR | 20821.296 | |
Immersion Oil, n = 1.518 | THORLABS | MOIL-10LF | Low autofluorescence |
Neurofilament (NF-M) antibody | DSHB | AB_531793 | |
Paraformaldehyde (PFA) | MERCK | 1.04005 | |
Synaptic vesicle glycoprotein 2 (SV2) antibody | DSHB | AB_2315387 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Materials | |||
Alnico Button cylindrical magnets | Farnell France | E822 | diameter of 19.1 mm with maximal pull of 1.9 Kg |
63x 1.4 NA magnitude oil immersion HCX Plan Apo CS objective | Leica Microsystems | ||
100x 1.4 NA HC PL APPO CS2 Objective | Zeiss | ||
Curved thin forceps-Moria iris forceps | Fine Science Tools | 11370-31 | |
Extra thin scissors – Vannas-Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15-003-08 | |
Fine serrated forceps | Euronexia | P-95-AA | |
Gel loading tip round 1-200 µL | COSTAR | 4853 | |
Leica laser-scanning confocal microscope TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
Leica Laser-scanning confocal microscope TCS SP8 Gated STED 775 nm | Leica Microsystems | ||
Lens Cleaning Tissue | Whatman (GE Healthcare) | 2105-841 | |
Medium serrated forceps | Euronexia | P-95-AB | |
Microscope cover glasses 24×50 nm No 1.5H 170±5 µm | Marienfield | 107222 | High precision |
Nunclon delta surface (12-well plates) | Thermo Scientific | 150628 | |
Nunclon delta surface (24-well plates) | Thermo Scientific | 142475 | |
Safeshield scalpel | Feather | 02.001.40.023 | |
Sharp-blunt scissors – fine Scissors – Martensitic Stainless Steel | Fine Science Tools | 14094-11 | |
Superfrost plus slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
Software | |||
GraphPad | Prism, San Diego (US) | Release N°6.07 | Statistical software |
ImageJ software | National Institutes of Health | Release N° 1.53f | |
Leica Application Suite X software | Leica Microsystems | Release N°3.7.2.2283 | Free microscope software available at https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/ |