Este protocolo describe un método para el análisis morfométrico de uniones neuromusculares mediante microscopía combinada confocal y STED que se utiliza para cuantificar cambios patológicos en modelos de ratón de SMA y CMS relacionados con ColQ.
Las uniones neuromusculares (NMJ) son sinapsis altamente especializadas entre las neuronas motoras inferiores y las fibras musculares esqueléticas que desempeñan un papel esencial en la transmisión de moléculas del sistema nervioso a los músculos voluntarios, lo que lleva a la contracción. Se ven afectados en muchas enfermedades humanas, incluidos los trastornos neuromusculares hereditarios como la distrofia muscular de Duchenne (DMD), los síndromes miasténicos congénitos (CMS), la atrofia muscular espinal (AME) y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Por lo tanto, el monitoreo de la morfología de las uniones neuromusculares y sus alteraciones en modelos de ratón enfermos representa una herramienta valiosa para estudios patológicos y evaluación preclínica de enfoques terapéuticos. Aquí, se describen métodos para etiquetar y analizar la morfología tridimensional (3D) de las partes pre y postsinápticas de las placas terminales motoras a partir de fibras musculares murinas. Se detallan los procedimientos para preparar muestras y medir el volumen, el área, la tortuosidad y la morfología/ocupación terminal del axón por imágenes confocales, y la distancia entre los pliegues de la unión postsináptica y el ancho de la banda del receptor de acetilcolina (AChR) mediante microscopía de agotamiento por emisión estimulada de súper resolución (STED). Las alteraciones en estos parámetros NMJ se ilustran en ratones mutantes afectados por SMA y CMS.
La unión neuromuscular (NMJ) es una estructura compleja compuesta por un terminal del axón motor, una célula de Schwann perisináptica y una porción de miofibra esquelética involucrada en la transmisión de información química y el acoplamiento de la actividad de la neurona motora inferior a la contracción muscular. En los mamíferos, la morfología de la unión neuromuscular cambia durante el desarrollo, adoptando una forma típica similar a un pretzel después de la maduración, con diferencias de forma y complejidad entre especies, y muestra cierto grado de plasticidad en respuesta a procesos fisiológicos como el ejercicio o el envejecimiento 1,2,3,4 . La placa terminal motora postsináptica forma invaginaciones de membrana llamadas pliegues de unión, donde la parte superior que contiene receptores de acetilcolina (AChR) está en estrecho contacto conla rama 5 del axón terminal presináptico.
Los cambios morfológicos y funcionales en las uniones neuromusculares contribuyen a la fisiopatología de varios trastornos neurodegenerativos como la atrofia muscular espinal (AME) y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), miopatías como la distrofia muscular de Duchenne (DMD), los síndromes miasténicos congénitos (CMS), la miastenia gravis (MG) y las miopatías centronucleares (CNM), y la sarcopenia asociada al envejecimiento 3,6,7,8,9, 10,11,12. En estas enfermedades, se observan alteraciones estructurales de NMJ como fragmentación de la placa terminal, reducción del tamaño del pliegue de la unión postsináptica y/o denervación. La patología de las NMJ puede ser un evento primario o temprano durante la progresión de la enfermedad o aparecer más recientemente como un evento secundario que contribuye a las manifestaciones clínicas. En cualquier caso, el seguimiento de la morfología de las NMJ en modelos animales de estas enfermedades representa un parámetro valioso para estudiar los cambios patológicos y evaluar la eficacia de los posibles tratamientos.
La morfología de las uniones neuromusculares suele analizarse mediante técnicas que utilizan microscopía confocal 2,13,14,15 o microscopía electrónica 5,16, con sus limitaciones inherentes como resolución o dificultades técnicas, respectivamente. Más recientemente, la microscopía de superresolución también se utilizó para visualizar regiones particulares de la NMJ, como las zonas activas presinápticas o la distribución de AChR en la membrana postsináptica16,17,18, como un enfoque alternativo o complementario al análisis ultraestructural por microscopía electrónica.
Este protocolo tiene como objetivo proporcionar un método detallado y reproducible para evaluar los parámetros morfológicos de NMJ mediante la combinación de microscopía de agotamiento por emisión estimulada y confocal de fluorescencia (STED). Las características importantes de las placas terminales presinápticas y postsinápticas, como el volumen, el área, la tortuosidad relativa, el ancho de la franja AChR y la distribución terminal axonal en las fibras musculares inervadas de gastrocnemio y tibial anterior de ratón se cuantificaron en el contexto de condiciones normales y enfermas. En particular, los defectos de NMJ se ejemplificaron en el modelo de ratón Smn2B / – de atrofia muscular espinal, una enfermedad neuromuscular con degeneración de la neurona motora causada por mutaciones en el gen SMN1 11,19, y en una subunidad de cola similar al colágeno de ratones con acetilcolinesterasa asimétrica (ColQ Dex2 / Dex2 o ColQ-KO), como modelo del síndrome miasténico congénito20, 21,22.
El protocolo de video descrito proporciona un método detallado para cuantificar la estructura 3D de las uniones neuromusculares mediante la combinación de microscopía confocal y STED que se puede utilizar para caracterizar los cambios patológicos en los niveles pre y postsináptico. La alta resolución de la microscopía STED permite la visualización y el análisis morfométrico de nanoestructuras que no son identificables por imágenes confocales convencionales. Este procedimiento nos permitió medir las alteraciones estructurales de las NMJ en dos músculos apendiculares, tibial anterior y gastrocnemio, de ratones SMA y CMS relacionados con ColQ.
Para obtener resultados confiables con esta técnica, es fundamental diseccionar y burlarse de los músculos correctamente, prestando especial atención a la fascia que rodea el músculo y la fuerza aplicada para separar los haces musculares; de lo contrario, el patrón de inervación podría interrumpirse impidiendo una evaluación presináptica adecuada de la NMJ. Aunque se proporciona información detallada para analizar las NMJ de TA y GA, en principio, este protocolo podría adaptarse a otros músculos, incluidos los músculos planos, como el diafragma o el abdomen transverso37, que no requieren el paso de burla. La fijación de los tejidos también es crucial para garantizar una tinción de buena calidad; por lo tanto, se recomienda usar PFA de alta calidad a un volumen apropiado (15-20 veces el del músculo). Además, el tiempo de exposición al fijador es un paso importante porque los artefactos, como la contracción y la aglutinación, pueden aparecer debido a la sobrefijación e influir en las características de NMJ. Dado el tamaño de las muestras y la velocidad de penetración de la solución de paraformaldehído en los tejidos38, se recomienda un tiempo de fijación de 18-24 h para este tipo de músculo. En caso de que el paso de tinción se planifique más de una semana después de la recolección de tejido, se sugiere mantener los músculos fijados con PFA en PBS suplementados con azida de sodio a 4 ° C para evitar la proliferación bacteriana.
Este protocolo presenta un enfoque que utiliza α-BTX-F488 para imágenes confocales y α-BTX-F633 para imágenes STED. Estos fluoróforos fueron elegidos para encajar con el diseño experimental descrito, pero pueden modificarse de acuerdo con el equipo y los materiales disponibles. Por ejemplo, se puede seleccionar el etiquetado α-BTX F488 cuando se utiliza un láser STED CW 592 nm para la adquisición y cuantificación de imágenes. Sin embargo, parece que la configuración que se aplicó en el presente estudio (STED de excitación pulsada cerrada, agotamiento de 775 nm) exhibe un mayor rendimiento y mejor resolución que otros enfoques, como la onda continua STED39, lo que la hace más adecuada para la aplicación actual. También es importante seleccionar cuidadosamente los ajustes de potencia del láser, especialmente para STED (tanto excitación como agotamiento), ya que las características de un perfil de intensidad no se pueden medir en caso de saturación y, por lo tanto, cualquier señal saturada en una imagen NMJ podría poner en peligro todo el análisis.
Este flujo de trabajo detallado, que incluye adquisiciones y análisis de imágenes utilizando software de microscopio y macros ImageJ, se desarrolló para facilitar el análisis morfométrico autónomo de NMJ mediante microscopía confocal y STED de un solo músculo. Los flujos de trabajo descritos anteriormente para el análisis confocal de NMJ, como NMJ-morph2 o NMJ-Analyser14, allanaron el camino para el diseño de métodos semiautomáticos que facilitan el análisis morfológico de NMJ y estudios comparativos. NMJ-morph (y su versión actualizada aNMJ-morph15) es una plataforma gratuita basada en ImageJ que utiliza la proyección de intensidad máxima para medir 21 características morfológicas, y NMJ-Analyser utiliza un script desarrollado en Python que genera 29 parámetros relevantes a partir de toda la estructura 3D NMJ. El umbral manual es el único paso durante el procesamiento de imágenes en estos dos métodos que requieren análisis del usuario. Este protocolo integrado detalla los pasos para la preparación de tejidos, las adquisiciones de imágenes confocales 3D y el procesamiento basado en ImageJ de NMJ de músculos esqueléticos completos y proporciona una visión general simplificada de cinco parámetros importantes de las placas terminales postsinápticas (volumen, área de proyección máxima y tortuosidad) y presinápticas (ocupación terminal del axón y acumulación de neurofilamentos). Un parámetro adicional de relevancia biológica, el patrón de organización AChR de los pliegues de unión postsinápticos, fue incorporado para el análisis morfométrico a nivel nanométrico por microscopía STED de superresolución (resolución 20-30 nm)40. Curiosamente, la preparación del tejido para imágenes STED es más simple que otros métodos utilizados para estudios ultraestructurales de NMJ, como la microscopía electrónica de transmisión convencional (TEM)9, que es un procedimiento bastante complejo y lento que requiere un manipulador experto para obtener secciones ultrafinas de la región muscular apropiada. Además, los datos cuantitativos de múltiples pliegues de unión se pueden obtener automáticamente utilizando el software asociado a STED.
Este protocolo se aplicó para ilustrar defectos NMJ previamente conocidos en músculos deficientes en SMN y ColQ 20,36,41,42. Se encontraron cambios comunes en los dos modelos de ratón por microscopía confocal, como disminución del volumen de la placa terminal postsináptica, área MIP y tortuosidad relativa, y aumento de la acumulación de neurofilamentos, mientras que algunos hallazgos más específicos (disminución de la ocupación de NMJ), se observaron solo en ratones SMA, como un indicador de tráfico de vesículas deterioradas36. Finalmente, se detectó un aumento en la distancia y anchura de la franja AChR en ColQ-KO mediante análisis STED, que son signos de defectos ultraestructurales en los pliegues de unión postsinápticos, como se observó previamente en TEM20. Es importante destacar que este protocolo puede ayudar en una caracterización morfológica más profunda de las uniones neuromusculares durante el desarrollo, el mantenimiento y bajo diversas condiciones patológicas.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a la “Imaging and Cytometry Core Facility” de Genethon, así como al servicio de histología, que cuentan con el apoyo parcial de fondos de equipos de la Región Ile-de-France, el Conseil General de l’Essonne, el Genopole Recherche de Evry, la Universidad de Evry Val d’Essonne y el INSERM, Francia. También agradecemos al Dr. Rashmi Kothary por proporcionar la línea de ratón Smn 2B/2B (Universidad de Ottawa, Canadá) y al Dr. Eric Krejci por la línea de ratón ColQDex2/+ (inédito, Universidad de París, Francia). Agradecemos a Guillaume Corre por su apoyo en el análisis estadístico. Los anticuerpos monoclonales 2H3 (desarrollados por Jessel, T.M. y Dodd, J.) y SV2 (desarrollados por Buckley, K.M.) se obtuvieron del Banco de Hibridoma de Estudios del Desarrollo (DSHB), creado por el NICHD del NIH y mantenido en la Universidad de Iowa, Departamento de Biología, Iowa City, IA 52242. Este trabajo fue apoyado por la Asociación Francesa contra las Miopatías (AFM-Teletón), el INSERM y la Universidad de Evry Val d’Essonne.
Buffers and Reagents | |||
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (F488) | Life Technologies, Thermofisher | A-11001 | |
Alexa Fluor 488 α-bungarotoxin (F488-a-BTX) | Life Technologies, Thermofisher | B13422 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (F594) | Life Technologies, Thermofisher | A-11032 | |
ATTO-633 α-bungarotoxin (F633-a-BTX) | Alomone Labs | B-100-FR | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
DAPI Fluoromount-G | Southern Biotech | 00-4959-52 | |
DPBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
Ethanol Absolute | VWR | 20821.296 | |
Immersion Oil, n = 1.518 | THORLABS | MOIL-10LF | Low autofluorescence |
Neurofilament (NF-M) antibody | DSHB | AB_531793 | |
Paraformaldehyde (PFA) | MERCK | 1.04005 | |
Synaptic vesicle glycoprotein 2 (SV2) antibody | DSHB | AB_2315387 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Materials | |||
Alnico Button cylindrical magnets | Farnell France | E822 | diameter of 19.1 mm with maximal pull of 1.9 Kg |
63x 1.4 NA magnitude oil immersion HCX Plan Apo CS objective | Leica Microsystems | ||
100x 1.4 NA HC PL APPO CS2 Objective | Zeiss | ||
Curved thin forceps-Moria iris forceps | Fine Science Tools | 11370-31 | |
Extra thin scissors – Vannas-Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15-003-08 | |
Fine serrated forceps | Euronexia | P-95-AA | |
Gel loading tip round 1-200 µL | COSTAR | 4853 | |
Leica laser-scanning confocal microscope TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
Leica Laser-scanning confocal microscope TCS SP8 Gated STED 775 nm | Leica Microsystems | ||
Lens Cleaning Tissue | Whatman (GE Healthcare) | 2105-841 | |
Medium serrated forceps | Euronexia | P-95-AB | |
Microscope cover glasses 24×50 nm No 1.5H 170±5 µm | Marienfield | 107222 | High precision |
Nunclon delta surface (12-well plates) | Thermo Scientific | 150628 | |
Nunclon delta surface (24-well plates) | Thermo Scientific | 142475 | |
Safeshield scalpel | Feather | 02.001.40.023 | |
Sharp-blunt scissors – fine Scissors – Martensitic Stainless Steel | Fine Science Tools | 14094-11 | |
Superfrost plus slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
Software | |||
GraphPad | Prism, San Diego (US) | Release N°6.07 | Statistical software |
ImageJ software | National Institutes of Health | Release N° 1.53f | |
Leica Application Suite X software | Leica Microsystems | Release N°3.7.2.2283 | Free microscope software available at https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/ |