אפיון צמתים עצביים-שריריים בעכברים על ידי מיקרוסקופיה משולבת קונפוקלית וסופר-רזולוציה

טיפול ומניפולציה בעכברים בוצעו על פי חקיקה לאומית ואירופאית בנושא ניסויים בבעלי חיים ואושרו על ידי ועדת האתיקה המוסדית. זכרים ונקבות של עכברי Smn 2B/- (רקע C57Bl/6J) ועכברי ColQ Dex2/Dex2 (רקע B6D2F1/J) בגיל 3 ו-6 שבועות, בהתאמה, שימשו במחקר. 1. המתת חסד של עכברים וכריתת שרירים: טיביאליס קדמי וגסטרוקנמיוס המשך להרדמה בעכבר על ידי הזרקה תוך-צפקית של קטמין (87.5 מ”ג/ק”ג)/קסילזין (12.5 מ”ג/ק”ג) תמיסה מעורבת (0.1 מ”ל/20 גרם משקל גוף) לפני המתת חסד על ידי נקע צוואר הרחם.הערה: מכיוון ש-SMA ו-ColQ-CMS משפיעים על אנשים ללא תלות במין שלהם, נעשה שימוש בעכברים זכרים ונקבות בפרוטוקול הנוכחי. הסירו את השיער האחורי באמצעות מכונת גילוח חשמלית קטנה ושטפו את הרגליים ב-70% אתנול.הערה: הליך הדיסקציה יהיה שונה עבור כל שריר. עבור דיסקציה של tibialis קדמי (TA), בצע את השלבים 1.2.1-1.2.3, ועבור gastrocnemius (GA) (חלקים מדיאליים ורוחביים), בצע את השלבים 1.2.4-1.2.6. טפל בשרירים בעדינות כדי למנוע נזק לרקמות וריסוק או מתיחה שלהם במהלך דיסקציה.הנח את העכבר במצב שכיבה. בצע חתך בעור של 5 מ”מ עם מספריים קהים חדים לאורך החלק האנטרו-חיצוני של החלק האחורי הדיסטלי, במקביל לטיביה, כדי לחשוף את השריר. השתמש במספריים דקים במיוחד כדי להסיר את החיתולית. חותכים תחילה את הגיד הדיסטלי (קרוב לכף) ולאחר מכן את הגיד הפרוקסימלי (קרוב לברך) באמצעות מספריים דקים במיוחד ומלקחיים דקים מעוקלים. טפלו בשריר בזהירות כדי למנוע נזק למיופייבר ולעצבים.הערה: יש לחתוך את הגיד הפרוקסימלי קרוב ככל האפשר לעצם כדי לקצור את השריר כולו. הניחו את העכבר במצב נוטה, השתמשו במספריים קהים חדים כדי לבצע חתך בעור מהחלק העליון של התא האחורי הדיסטלי עד לכפה, והסירו את העור. תפסו את גיד אכילס במלקחיים משוננים בינוניים, חתכו אותו במספריים דקים במיוחד והפרידו בעדינות את ה-GA מהרקמה הסובבת אותו בחזרה להחדרתו הפרוקסימלית. בצד הפרוקסימלי, הכנס את המלקחיים המשוננים הבינוניים לכיס שנוצר בין שרירי הזרוע femoris (BF) לבין ה- GA. הפרד את שני השרירים כדי לחתוך את גיד ה- GA קרוב ככל האפשר להחדרת העצם באמצעות מספריים דקים במיוחד. לקיבוע רקמות, יש להכניס כל שריר לצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ”ל המכיל 1 מ”ל של 4% תמיסת פרפורמלדהיד (PFA) המדוללת במלח מאגר פוספט (PBS ללא Ca 2+Mg 2+) ולשמור על טמפרטורה של 4°C למשך18-24 שעות.אזהרה: פרפורמלדהיד ופורמלדהיד הם רעילים ויש לטפל בהם במכסה אדים כימי עם ציוד מגן מתאים. למחרת, שטפו את השרירים הקבועים 3x למשך 5 דקות עם PBS בצלחות של 12 בארות על ידי ניעור עדין בטמפרטורת החדר (RT) בתוך מכסה אדים כימי.הערה: ניתן לעצור את הפרוטוקול בשלב זה ולהמשיך אותו תוך חודש. במקרה זה, להוסיף PBS בתוספת 0.01% נתרן אזיד כדי לאחסן דגימות ב 4 °C (64 °F). הקניטו כל שריר בצרורות סיבים קטנים ברוחב של כ-1 מ”מ באמצעות שני מלקחיים משוננים עדינים.הערה: חשוב מאוד לתמרן את השרירים בעדינות רבה עם המלקחיים, ללא כוח מוגזם, כדי למנוע נזק לרקמות במהלך ההקנטה.נתקו את שריר ה-TA ל-3 או 4 צרורות בהתאם לגודלו. עבור GA, להפריד את החלקים המדיאליים והרוחביים של השריר ולאחר מכן לנתק כל חלק לתוך 4-5 צרורות בהתאם לגודלם. 2. אימונוסטינינג המשך עם חדירת סיבי שריר: העבר את צרורות השרירים ל-24 צלחות המכילות 1% (v/v) Triton X-100 ב-PBS ושמור אותם תחת תסיסה עדינה (50 סל”ד) למשך שעה אחת ב-RT או 5 שעות ב-4°C.הערה: פצלו את צרורות השרירים בין שתי צלחות כדי להמשיך עם תופעות חיסון נפרדות וכדי למזער את הסיכון לבלבול נוגדנים. אין לפצל אותם ליותר משתי בארות (באר אחת / צלחת); אחרת, המספר (N) של NMJs המייצגים את מעמדם הכללי בשריר המנותח עשוי להיות לא מספיק. שטפו את הדגימות 3x במשך 5 דקות עם PBS ב-RT ודגרו אותן עם תמיסת חסימה המורכבת מ-4% אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-PBS/Triton X-100 1% למשך 4 שעות ב-4 מעלות צלזיוס, תחת תסיסה עדינה (50 סל”ד).הערה: אין להשתמש במשאבת שאיפה במהלך שלבי הכביסה, אלא לשאוף את התמיסה באופן ידני עם פיפטה של 200 μL וטיפים בגודל קטן (ההפניה מצוינת בטבלת החומרים). דגירה של הדגימות למשך הלילה (O/N) ב-4 מעלות צלזיוס תחת תסיסה עדינה (50 סל”ד) כאשר תמיסת החסימה מסומנת בשלב 2.2 המכילה נוגדנים חד-שבטיים ראשוניים נגד נוירופילמנט M (NF-M, 2H3, דילול 1/200) או גליקופרוטאין שלפוחית סינפטית 2 (SV2, דילול 1/200) כדי לסמן מסופי אקסון קדם-סינפטיים או אזורים פעילים, בהתאמה. למחרת, לשטוף את צרורות השרירים 3x במשך 5 דקות PBS תחת תסיסה (50 סל”ד).להדמיה קונפוקלית: דגירה של צרורות השרירים עם נוגדנים משניים נגד עכברים המצומדים עם פלואורופור פולט אדום (F594) (דילול 1/500) ו-α-בונגארוטוקסין מצומד עם פלואורופור פולט ירוק (α-BTX-F488) (דילול 1/1000) ב-PBS למשך שעתיים ב-RT תחת תסיסה (50 סל”ד). להדמיית STED: דגירה על צרורות השרירים עם נוגדנים משניים נגד עכברים המצומדים עם פלואורופור פולט ירוק (F488) (דילול 1/500) ו-α-בונגארוטוקסין מצומד עם פלואורופור פולט אדום רחוק המאופיין ביציבות פוטו-יציבה גבוהה (α-BTX-F633) (דילול 1/1000) ב-PBS למשך שעתיים ב-RT תחת תסיסה (50 סל”ד).הערה: אין לחשוף את הדגימות לאור במהלך הדגירה כדי למנוע הלבנת תמונות. שטפו את צרורות השרירים המסומנים 3x למשך 5 דקות עם PBS תחת תסיסה (50 סל”ד) והניחו אותם על מגלשה עם מדיום הרכבה.הערה: יש להניח לכל היותר 4 עד 5 חבילות שרירים בכל שקופית כדי לאפשר איטום. הוסף כיסוי זכוכית דרגה #1.5 (או #1.5H) (עובי 0.17 מ”מ) בחלק העליון, והנח מגנטים גליליים משני צידי המגלשה כדי להפעיל לחץ ולשטח את השרירים. שמור על המגלשות מוגנות מפני O/N קל בטמפרטורה של 4°C. אטמו את השקופיות לצמיתות בעזרת לק. 3. רכישת תמונה רכישות על ידי מיקרוסקופ קונפוקליהערה: התמונות נאספו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך לסריקת לייזר באמצעות מטרת טבילת שמן בעוצמה של פי 63 (HCX Plan Apo CS, צמצם מספרי 1.4 (NA)).לניתוח עיוור, תן לאדם שאינו מעורב בניתוח לקודד כל שקופית עם מספר נתון. הישארו עיוורים לקבוצות הניסוי עד לכימות הפרמטרים של NMJ עבור כל הדגימות. הפעל את תוכנת המיקרוסקופ במצב תצורה > machine.xlhw (איור משלים 1). מקם את השקופית על במת המיקרוסקופ ומצא את מישור התצפית בתוך הדגימה על ידי הסתכלות תחת תאורת פלואורסצנציה בשדה רחב של DAPI עם ערכת מסנן DAPI. לחץ על פתח פרוייקט > פרוייקטים חדשים וצור תיקיה לאחסון רכישות תמונות (איור משלים 1).הערה: צור פרוייקט חדש עבור כל NMJ כדי להגביל את גודל התיקיה ולמנוע בעיות בזיכרון המחשב. כדי לנהל פרמטרים של רכישה, לחץ על חלון הכרטיסייה רכישה והגדר את חור הסיכה הקונפוקלי ליחידה אוורירית 1.0 וכוח לייזר כדי למטב את רמות הרווח וההיסט עבור הפלואורסצנציה הירוקה/F488 (α-BTX) באמצעות לייזר של 488 ננומטר בלוח הקצה שיש לדמות (מצב Live ON). לאחר מכן, מטב את רכישת הפלואורסצנציה האדומה/F594 (NF-M או SV2) באמצעות לייזר המותאם לתצפית F594. במחקר זה נעשה שימוש בלייזר של 552 ננומטר ( מצב Live Mode ON). הגדר את ספקטרום פליטת הצבעים עם הטווחים הבאים עבור כל לייזר: לייזר 405 (DAPI) מ- 414 עד 483 ננומטר, לייזר 488 (F488-α-BTX) בין 506-531 ננומטר ולייזר 552 (NF-M/SV2) בין 622-650 ננומטר. אסוף ערימות תמונות של צמתים עצביים-שריריים בכל קבוצת ניסוי עם אותן הגדרות: גודל תמונה 1024 x 1024 פיקסלים (73.7 x 73.7 מיקרומטר) בקצב דגימה של 400 הרץ, X מופעל דו-כיווני, גורם זום 2.5, גודל Z-step 0.5 מיקרומטר במצב Z-Wide.הערה: עבור כל NMJ, מספר הפרוסות מוגדר לרכישת הצומת כולו. הגדרות הרכישה שתוארו לעיל ממלאות את משפט הדגימה של ניקוויסט-שנון. עם זאת, המשתמש יכול ללחוץ על כפתור מיטוב פורמט , הקיים בכל תוכנות ההפעלה הקונפוקליות האחרונות, כדי להבטיח שגודל הפיקסל ושלב Z יעמדו בקצב הדגימה האידיאלי של Nyquist. פעולה זו תימנע מתמונות שנדגמו מעל או מתחת לנדגימה, מה שיגרום לאובדן דיוק במדידות עוצמת הקול. שמור את הקובץ המקורי ( .lif) או תמונות Z-stack (.tif) בתיקייה עם שם הכולל את שם הקוד של השקופית, סוג הצביעה ומספר לוחית הקצה.הערה: אסוף ברצף (לא בו-זמנית) את הסריקות באמצעות לייזרים של 488 ננומטר ו-552 ננומטר (F488 ו-F594) כדי להימנע מהצלבה של פלואורסצנציה של F488 לערוץ F594 ולהיפך (גלישה). NB: ניתן להגדיר את נתיב הקרן באמצעות עוזר הצבע בתוכנת המיקרוסקופ. עבור לשקופית המקודדת הבאה וחזור על שלבים 3.1.3-3.1.8 עבור כל NMJ. בסוף ההפעלה, לחץ על פתח במציג 3D ובחר נציג NMJ של קבוצת ניסוי כדי לדמיין את התיוג התלת-ממדי.הערה: מצב תצוגה זה יעזור לוודא שפרמטרי הרכישה היו נכונים. סגור את תוכנת המיקרוסקופ, נקה את המטרות עם רקמות העדשה ולאחר מכן כבה את המערכת. רכישות על ידי מיקרוסקופיית STEDהערה: התמונות נאספו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך לסריקת לייזר המצויד ב-STED מגודר בגודל 775 ננומטר באמצעות מטרת טבילת שמן פי 100 (HC PL APO CS2 1.4 NA).לניתוח עיוור, תן לאדם שאינו מעורב בניתוח לקודד כל שקופית עם מספר נתון. הישארו עיוורים לקבוצות הניסוי עד לכימות הפרמטרים של NMJ עבור כל הדגימות. הפעל את תוכנת המיקרוסקופ במצב תצורה > machine.xlhw ו- STED ON (איור משלים 2). לחץ על פתח פרוייקט > פרויקטים חדשים כדי ליצור תיקיה לאחסון רכישות תמונות.הערה: צור תיקיה חדשה עבור כל שקופית כדי להגביל את גודל התיקיה ולמנוע בעיות בזיכרון המחשב. הנח את השקופית על במת המיקרוסקופ וצפה בה תחת תאורת פלואורסצנציה בשדה רחב באמצעות לייזר 488 ננומטר כדי למצוא את מישור התצפית בתוך הדגימה. חפש NMJ המסומן בכתמי נוירופילמנט M (NF-M) או SV2 באמצעות לייזר 488 ננומטר עם גילוי ספקטרלי מ-506-531 ננומטר. כאשר זוהה NMJ, לחץ על הפעל STED והתחל לרכוש תמונות באזור המכיל מספר קיפולים צמתים (איור משלים 3) באמצעות לייזר 635 ננומטר עם גילוי ספקטרלי בין 640-750 ננומטר.הערה: הקפד על טבלת בדיקת הרוויה במהלך רכישת תמונה ולחץ על הלחצן Quick LUT כדי למנוע חשיפת יתר (ערכים אפורים >255; עבור 8 סיביות). אסוף את התמונות של כל קבוצת ניסוי עם אותן הגדרות: גודל תמונה 2048 x 2048 פיקסלים (38.75 x 38.75 מיקרומטר) בקצב דגימה של 400 הרץ.הערה: עוצמת הלייזר המתרוקנת (STED) מוגדרת ל-65%. שמור את התמונות בשם קובץ הכולל את הקוד של השקופית.הערה: ניתן ללחוץ על פורמט XY ממוטב: הגדר פורמט כדי להשיג את הגדרת הרכישה הטובה ביותר עם הדמיית STED. עבור לשקופית המקודדת הבאה וחזור על שלבים 3.2.3-3.2.8. חזור על הליך זה עבור כל השקופיות. בתום המיקרוסקופיה של STED, העבר את קבצי התמונה למחשב אחר ושמור את הקבצים המקוריים (. lif) בכונן חיצוני או בשרת. כבה את תוכנת המיקרוסקופ, נקה את המטרות עם רקמות העדשה ולאחר מכן כבה את המערכת. 4. ניתוח תמונה – מיקרוסקופיה קונפוקלית הערה: כל התמונות עובדו עם מחשבים המשתמשים במערכת ההפעלה המקצועית Microsoft Windows 10. הפעל את ImageJ ומאקרו מותאם אישית כדי לחשב נפח לוחית קצה NMJ פוסט-סינפטית, אזור הקרנה בעוצמה מרבית (MIP) וטורטואוזיות יחסית.עיבוד ערימות תמונות NMJ באמצעות NIH ImageJ תוכנה חופשית23, תוסף iGeodesic והמאקרו המותאם אישית לקבלת מדידות פרמטרים NMJ. הפעל את תוכנת ImageJ.הערה: הגרסה העדכנית ביותר של ImageJ זמינה בחינם וניתן להורידאותה 24. על מנת לפתוח פורמטים של קבצים קנייניים, יש להוריד את התוסף Bio-Formats Package25 26 . שלב זה אינו הכרחי במקרה שהמפעיל משתמש בפיג’י מכיוון שהתוסף כבר מותקן בתוכנה. תוסף iGeodesic27 למחשוב טורטואוזיות זמין גם באינטרנט28; ודא את הזמינות של תוסף זה בגרסת ImageJ/Fiji שבה ייעשה שימוש. פקודות המאקרו המותאמות אישית זמינות גם באינטרנט29. גרור ושחרר את Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal.ijm (מותאם אישית, קובץ קידוד משלים 1) לחלון ImageJ; המאקרו יהיה פתוח בחלון שני. בחלון חדש זה, לחץ על פקודות מאקרו > הפעל מאקרו.הערה: המאקרו יכול לעבד הן קבצים קנייניים והן קבצי TIFF. קבצים חייבים לעמוד בקריטריונים הבאים: לתבניות קובץ קנייניות, שמור רק צומת אחד (כלומר, אוסף התמונות) לכל קובץ, מסודר בתיקייה; בתמונות TIFF, יש לשמור קבצים בתיקייה המכילה תיקיות משנה, שכל אחת מהן נקראת JunctionX (X מתאים למספר NMJ) עם אוספי התמונות של צומת נתון (RGB TIFF) (איור משלים 4). בחר את התיקיה המקורית המכילה את תיקיות המשנה של Junction שיש לנתח ולחץ על בחר. בתפריט המוקפץ החדש שנקרא שמירת תיקיה, בחר את תיקיית האחסון ולחץ על בחר. בתפריט הנפתח החדש שנקרא Image Type, בחר את התבנית של רכישות Z-stack. בחר בערוץ RGB המתאים לצביעת העניין וציין גודל פיקסלים XY ושלב Z (z). המאקרו יבצע את הניתוח באופן אוטומטי.הערה: אם נבחרו תבניות קובץ קנייניות, המאקרו קורא ישירות את גודל הפיקסלים ואת Z-step (z). עם זאת, המשתמש עדיין צריך לציין את ערוץ העניין (C1, C2 או C3). המאקרו יספק גליון נתונים (.csv) עבור כל פרמטר צומת (אמצעי אחסון של לוחית קצה, אזור MIP וטורטואוזיות) בתיקיית השמירה. המאקרו גם יוצר שלושה . קבצי TIF , התואמים את ההיקף של Drawing_MaxprojX.tif צביעת α-BTX, DrawingJunctionX.tif ו- MIP MaxprojX.tif. קובצי TIFF אלה נוצרים כדי לאמת את איכות הרכישות וכדי להבטיח שעיבוד התמונה בוצע כהלכה.אמצעי אחסון NMJ פוסט-סינפטי (V): המאקרו יפריד תמונות מ- NMJ יחיד וישמור על ערוץ α-bungarotoxin F488 המתאים ללוחית הקצה הפוסט-סינפטית. המחסנית מפולחת באמצעות סף Otsu30 על פרוסת הביניים של הערימה. התמונה הבינארית המתקבלת מורחבת בפיקסל אחד, והתכונה ‘ניתוח חלקיקים ‘ משמשת למדידת אזור לוחית הקצה של כל עצם שזוהה. כדי לקבל את נפח NMJ הפוסט-סינפטי, המאקרו מסכם את כל אזורי לוחית הקצה הנמדדים של הערימה ומכפיל אותה בערך Z-step (z) ב- μm.אזור לוחית קצה של הקרנה בעוצמה מרבית (MIP): לאחר סף הערימה, ההקרנה בעוצמה מרבית (MIP) מתקבלת באמצעות התכונה ImageJ של Z-project . התכונה ‘נתח חלקיקים ‘ משמשת לאחר מכן לכימות אזור לוחית הקצה של MIP.טורטואוזיות NMJ MIP (T): טורטואוזיות NMJ, המשקפת את מידת המורכבות של לוחית הקצה המוטורית הפוסט-סינפטית כולל קפלים ונקבים31, מחושבת על סמך כל MIP באמצעות הנוסחה הבאה, כאשר d Obj(AB) הוא המרחק בין A ל-B לאורך היקף האובייקט, ו-dEuc(AB) הוא המרחק האוקלידי בין A ל-B (קו ישר). הגדר את ערך הטורטואוזיות הגבוה ביותר בקבוצת הסוג הפראי של כל תנאי ניסוי ל- 100%, ונרמל את כל הערכים האחרים של תנאי הניסוי לערך זה על מנת לקבל את הטורטואוזיות היחסית של NMJ. הפעל את ImageJ ומאקרו מותאם אישית כדי לכמת הצטברות נוירופילמנט קדם-סינפטי וכתם גליקופרוטאין שלפוחית סינפטית 2.הערה: הצטברות נוירופילמנט (כאן, NF-M) ו/או התפלגות שונה של שלפוחיות סינפטיות (כאן, SV2) הם סמנים של הובלה אקסונאלית חריגה ו / או סחר שלפוחית לקוי ונצפו בעבר ב- NMJs של מודלים שונים של עכברי SMA32,33,34.גרור ושחרר את Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal.ijm (מותאם אישית, קובץ קידוד משלים 2) לחלון ImageJ; המאקרו ייפתח בחלון שני. בחלון חדש זה, לחץ על פקודות מאקרו > הפעל מאקרו.הערה: המאקרו יכול לעבד הן תבניות קובץ קנייניות והן קבצי TIFF. הקבצים חייבים לעמוד בקריטריונים המצוינים בהערה שלהלן שלב 4.1.2. בחר את התיקיה המקורית המכילה את תיקיות המשנה של Junction שיש לנתח ולחץ על בחר. בתפריט המוקפץ החדש שנקרא שמירת תיקיה, בחר את תיקיית האחסון ולחץ על בחר. בתפריט הנפתח החדש שנקרא Image Type, בחר את התבנית של רכישות Z-stack. בחלון המוקפץ Staining Infos , ציין את התווית והצבע הקדם-סינפטיים והפוסט-סינפטיים ולחץ על אישור. לדוגמה, תווית קדם-סינפטית: SV2 או NF, צבע קדם-סינפטי: R, תווית פוסט-סינפטית: BTX, צבע פוסט-סינפטי: G.הערה: עבור תבניות קובץ קנייניות, יש לציין תוויות וערוצים מתאימים (C1, C2 או C3). בחלון המוקפץ גודל פיקסל , ציין גודל פיקסל XY 0.072 מיקרומטר ו- Z שלב 0.5 מיקרומטר (z) ולחץ על אישור. המאקרו יבצע את הניתוח באופן אוטומטי.הערה: פרמטר זה מתאים לגודל התמונה 1024 x 1024 פיקסלים (73.7 x 73.7 מיקרומטר) שנבחר לפני רכישת מיקרוסקופ קונפוקלי, והוא מתואם להגדרות המטרה והזום. אם נבחרו תבניות הקובץ הקנייניות, המאקרו יקרא ישירות את גודל הפיקסלים ואת Z-step (z). המאקרו יאחסן, בתיקיית השמירה, גליון נתונים (.csv) של אמצעי אחסון קדם-סינפטיים ופוסט-סינפטיים, תמונת TIFF מרובת עמודים של הזיהוי הנוכחי עבור כל תיוג (טרום ופוסט-סינפטי). כפי שצוין לעיל, קבצי TIFF אלה נוצרים כדי לבדוק את איכות הרכישות וכדי להבטיח שעיבוד התמונה בוצע כראוי.המאקרו מחשב את הנפח של צביעת נוירופילמנט M אקסונאלית (נפח NF) מערוץ NF-M-F594 המתמזג עם תיוג α-bungarotoxin-F488 ואת הנפח של צביעת גליקופרוטאין 2 שלפוחית סינפטית NMJ (נפח SV2) מערוץ SV2-F594 המתמזג עם תיוג α-BTX-F488. הצטברות NF-M מכמתת על ידי חישוב היחס בין נפח NF לנפח לוחית קצה פוסט-סינפטית (α-BTX) ותפוסת מסוף האקסון NMJ לפי היחס בין נפחי SV2 ו- α-BTX, כפי שמוצג להלן. 5. ניתוח תמונה – מיקרוסקופיית STED הערה: עיבוד התמונה בוצע באמצעות תוכנה לא מקוונת של יצרן מיקרוסקופ STED. הפעל את תוכנת המיקרוסקופ. פתח את הפרויקט על ידי לחיצה על פתח פרויקט לחצן. בחר את קובץ הפרוייקט ( .lif) ופתח אותו. התמונות מוצגות על המסך יחד עם שמותיהן. בחלון תהליך : לחץ על הפחתת רעש > חציון. בתחתית החלון האמצעי, הגדר את רדיוס ל- 5.00 ואת איטרציה ל- 1.00, ובטל את הסימון של סינון תלת-ממדי. לאחר מכן בחר את פרויקטים פתוחים הכרטיסייה בפינה השמאלית העליונה של החלון ובחר תמונה. לחץ על החל כדי לאמת פרמטרים. תמונה חדשה בשם “nameofimage_median001” נוצרת.הערה: ניתן ללחוץ על תצוגה מקדימה לפני החל כדי לפקח על ההשפעה של המסנן החציוני, אשר ישפר את ניגודיות התמונה ויחליק את פרופילי הקו המשמשים לכימות. החל את המסנן על כל התמונות כפי שמצוין בשלבים 5.4-5.5. בכרטיסיות פרויקטים פתוחים , לחץ על סמל כונן התקליטונים כדי לשמור את כל הפרויקטים, כולל התמונות המסוננות החדשות שנוצרו.הערה: השלב הבא ייעשה באמצעות התמונה המסוננת בשם “nameofimage_median001”. חישוב המרחק בין פסי AChRהערה: שינויים במורפולוגיה של קפלים פוסט-ג’נטוריים נצפים לעתים קרובות בהפרעות נוירומוסקולריות כסימן לפתולוגיה של NMJ (חוסר בגרות או ניוון). המרחק (d) בין פסי AChR, המזוהים על ידי צביעת α-בונגארוטוקסין, מחושב על ידי יצירת פרופילי עוצמה וכימות המרחק בין כל שיא עוצמה מקסימלית על ידי ציור פרופיל קו (איור משלים 5).באמצעות תוכנת המיקרוסקופ, בחר בתפריט כימות בחלק העליון של החלון המרכזי. לחץ על כלים הכרטיסייה בפינה הימנית העליונה. בחר עוצמה בחלונית השמאלית העליונה ולחץ על סמל פרופיל קו . הגדר דגימת יתר ל- 1, וסמן את מיין ערוצים. לחץ על הכרטיסיות פתח פרויקטים ובחר את התמונה המסוננת לניתוח.הערה: ניתן להגדיל את התצוגה של התמונה על-ידי גלילה באמצעות עכבר המחשב. ניתן לשנות את הטווח הדינמי של התמונה באמצעות הסרגל בצד שמאל ליד התמונה המוצגת, מה שמקל על ההדמיה של הפסים. לאחר מכן, לחץ על לצייר קו סמל בתפריט העליון של החלון הימני ולעקוב אחר קו חוצה בניצב כמה פסים / קיפולים צומתיים.הערה: פרופיל העוצמה מוצג בחלון המרכזי. לחץ על החלק העליון של השיא הראשון והזז את מצביע העכבר תוך שמירה על לחצן העכבר השמאלי לחוץ עד להגעה לשיא המרבי הבא.הערה: המידע מוצג בפרופיל העוצמה, בעוד שהמרחק בין שתי הפסגות מוצג מתחת לתרשים עם המלים “dx”. לחץ ימינה על העכבר בזמן שאתה בתמונה של החלון הימני ובחר שמור ROIs. פתח את ה- ROIs שנשמרו (אזורי עניין) על ידי לחיצה על טען ROIs. לחץ על סמל החץ בפינה השמאלית העליונה של החלון הימני, לחץ על החזר ההשקעה ומחק אותו על ידי לחיצה על סמל הפח. חזור על פעולה זו כמה פעמים שנדרש מפרופילי עוצמה שונים כדי לקבל את המספר החזוי של מרחקי פס AChR שייצגו את הערך הגלובלי בשריר המנותח.הערה: ניתן לחשב מראש את ערך N האופטימלי בהתבסס על ההפרש המשוער בין קבוצות, סיכון α, הספק ומבחן זנב אחד או שניים. בתכנון הניסוי הנוכחי, הוחל מבחן מאן-וויטני חד-זנב (סיכון α = 10%; הספק = 80%), וערך ה-N הוערך כחמישה מרחקי פס AChR לפחות לכל NMJ על מנת להשוות בין שתי קבוצות בעלי החיים. רוחב פס AChRהערה: רוחב הפס (w) מתאים לחצי הרוחב המלא המרבי (FWHM) של פרופיל העוצמה, שהוא המרחק בין הנקודות שבהן ערך הפלואורסצנציה של האות α-BTX הוא מחצית מעוצמתו המרבית (איור משלים 5).באמצעות תוכנת המיקרוסקופ, בחר בתפריט כימות בחלון המרכזי. לחץ על כלים הכרטיסייה בצד שמאל למעלה. בחר עוצמה בחלונית השמאלית העליונה ולחץ על הסמל קבע FWHM . סמן ערוצי מיון.הערה: כדי למטב את זיהוי השיא על-ידי התוכנה, הגדר סף ורוחב הוגדרו ל- 50 ו- 3, בהתאמה. התאימו את הערכים הללו לכל ניסוי ובקשו עצה ממדען הדמיה מנוסה. לחץ על הכרטיסיות פתח פרויקטים ובחר את התמונה המסוננת לניתוח.הערה: ניתן להגדיל את התצוגה של התמונה המוצגת בחלון הימני על-ידי גלילה באמצעות עכבר המחשב. כפי שצוין לעיל (הערה לאחר שלב 5.8.3), ניתן לשנות את הטווח הדינמי של התמונה להדמיית פס אופטימלית. לאחר מכן, לחץ על צייר סמל מלבן בתפריט העליון של החלון הימני. בחר פס אופקי או אנכי וצייר מלבן בניצב לפס. פרופיל מופיע בחלון המרכזי. לחץ על אנכי או אופקי בתפריט הקרנה ממוצעת הממוקם בחלונית השמאלית, בהתאם לכיוון הפס האנכי או האופקי. לחץ על סטטיסטיקה בחלון המרכזי וקרא את הערך FWHM. בצע לחיצה ימנית עם עכבר המחשב על התמונה המוצגת בחלון הימני ובחר שמור ROIs.הערה: פתח את ה- ROIs שנשמרו על ידי לחיצה על טען ROIs. לחץ על סמל החץ בפינה השמאלית העליונה של החלון הימני, לחץ על החזר ההשקעה ומחק אותו על ידי לחיצה על סמל הפח. חזור על פעולה זו כמה פעמים שנדרש מ- ROIs מלבניים שונים עד לקבלת המספר החזוי של רוחב פס AChR, אשר ייצג את הערך הגלובלי בשריר המנותח. 6. תכנון ניסויים ובדיקות סטטיסטיות בצע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות תוכנה ספציפית.הערה: הנתונים נאספו מ-N ≥ 3 שכפולים ביולוגיים ולפחות 20 NMJs לכל גנוטיפ להדמיית מיקרוסקופ קונפוקלי, ו-N ≥ 5 שכפולים ביולוגיים ו-N = 5 NMJs לכל גנוטיפ להדמיית STED, בכל קבוצת ניסוי. המובהקות הוערכה על ידי מבחן מאן-וויטני הלא מזווג (לא-פאראמטרי), וערכי p מצוינים במקרא האיורים המתאים.