Ce protocole décrit une méthode d’analyse morphométrique des jonctions neuromusculaires par microscopie confocale et STED combinée qui est utilisée pour quantifier les changements pathologiques dans les modèles murins de SMA et de CMS liés à ColQ.
Les jonctions neuromusculaires (JNM) sont des synapses hautement spécialisées entre les motoneurones inférieurs et les fibres musculaires squelettiques qui jouent un rôle essentiel dans la transmission des molécules du système nerveux aux muscles volontaires, conduisant à la contraction. Ils sont affectés dans de nombreuses maladies humaines, y compris les troubles neuromusculaires héréditaires tels que la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), les syndromes myasthéniques congénitaux (CMS), l’amyotrophie spinale (SMA) et la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Par conséquent, la surveillance de la morphologie des jonctions neuromusculaires et de leurs altérations dans les modèles murins de maladie représente un outil précieux pour les études pathologiques et l’évaluation préclinique des approches thérapeutiques. Ici, les méthodes de marquage et d’analyse de la morphologie tridimensionnelle (3D) des parties pré- et postsynaptiques des plaques d’extrémité motrices à partir de fibres musculaires murines taquinées sont décrites. Les procédures de préparation des échantillons et de mesure du volume, de la surface, de la tortuosité et de la morphologie/occupation terminale de l’axone par imagerie confocale, ainsi que la distance entre les plis jonctionnels postsynaptiques et la largeur de bande du récepteur de l’acétylcholine (AChR) par microscopie à déplétion par émission stimulée à super-résolution (STED) sont détaillées. Les altérations de ces paramètres NMJ sont illustrées chez des souris mutantes affectées par SMA et CMS.
La jonction neuromusculaire (NMJ) est une structure complexe composée d’un axone moteur terminal, d’une cellule de Schwann périsynaptique et d’une partie de myofibre squelettique impliquée dans la transmission de l’information chimique et le couplage de l’activité des motoneurones inférieurs à la contraction musculaire. Chez les mammifères, la morphologie de la jonction neuromusculaire change au cours du développement, adoptant une forme typique de bretzel après la maturation, avec des différences de forme et de complexité entre les espèces, et montre un certain degré de plasticité en réponse à des processus physiologiques tels que l’exercice ou le vieillissement 1,2,3,4 . La plaque motrice postsynaptique forme des invaginations membranaires appelées plis jonctionnels, où la partie supérieure contenant les récepteurs de l’acétylcholine (AChR) est en contact étroit avec la branche5 de l’axone terminal présynaptique.
Les changements morphologiques et fonctionnels dans les jonctions neuromusculaires contribuent à la physiopathologie de plusieurs troubles neurodégénératifs tels que l’amyotrophie spinale (SMA) et la sclérose latérale amyotrophique (SLA), les myopathies comme la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), les syndromes myasthéniques congénitaux (CMS), la myasthénie grave (MG) et les myopathies centronucléaires (CNM), et la sarcopénie associée au vieillissement 3,6,7,8,9, 10,11,12. Dans ces maladies, on observe des altérations structurelles de la NMJ telles que la fragmentation de la plaque terminale, la réduction de la taille du pli jonctionnel postsynaptique et / ou la dénervation. La pathologie des NMJ peut être un événement primaire ou précoce au cours de la progression de la maladie ou apparaître plus récemment comme un événement secondaire contribuant aux manifestations cliniques. Dans tous les cas, le suivi de la morphologie des NMJ dans des modèles animaux de ces maladies représente un paramètre précieux pour étudier les changements pathologiques et évaluer l’efficacité des traitements potentiels.
La morphologie des jonctions neuromusculaires est généralement analysée par des techniques utilisant la microscopie confocale 2,13,14,15 ou la microscopie électronique 5,16, avec leurs limitations inhérentes telles que la résolution ou les difficultés techniques, respectivement. Plus récemment, la microscopie à super-résolution a également été utilisée pour visualiser des régions particulières de la NMJ, telles que les zones actives présynaptiques ou la distribution AChR sur la membrane postsynaptique16,17,18, comme approche alternative ou complémentaire à l’analyse ultrastructurale par microscopie électronique.
Ce protocole vise à fournir une méthode détaillée et reproductible pour évaluer les paramètres morphologiques NMJ en combinant la microscopie confocale à fluorescence et la microscopie à déplétion par émission stimulée (STED). Des caractéristiques importantes des plaques terminales présynaptiques et postsynaptiques, telles que le volume, la surface, la tortuosité relative, la largeur de la bande AChR et la distribution terminale de l’axone dans les fibres musculaires innervées de gastrocnémiens et tibiaux antérieurs de souris ont été quantifiées dans le contexte de conditions normales et malades. En particulier, les défauts de la NMJ ont été illustrés dans le modèle murin Smn 2B / – de l’amyotrophie spinale, une maladie neuromusculaire avec dégénérescence des motoneurones causée par des mutations du gène SMN1 11,19, et dans une sous-unité de queue semblable au collagène de souris asymétriques à knockout de l’acétylcholinestérase (ColQ Dex2 / Dex2 ou ColQ-KO), comme modèle du syndrome myasthénique congénital 20, 21,22.
Le protocole vidéo décrit fournit une méthode détaillée pour quantifier la structure 3D des jonctions neuromusculaires en combinant la microscopie confocale et la microscopie STED qui peuvent être utilisées pour caractériser les changements pathologiques aux niveaux pré- et postsynaptique. La haute résolution de la microscopie STED permet la visualisation et l’analyse morphométrique de nanostructures qui ne sont pas identifiables par imagerie confocale conventionnelle. Cette procédure nous a permis de mesurer les altérations structurelles des JNM dans deux muscles appendiculaires, tibial antérieur et gastrocnémien, de souris CMS liées à la SMA et à la ColQ.
Pour obtenir des résultats fiables avec cette technique, il est essentiel de disséquer et de taquiner correctement les muscles, en accordant une attention particulière au fascia entourant le muscle et à la force appliquée pour séparer les faisceaux musculaires; sinon, le schéma d’innervation pourrait être perturbé empêchant une évaluation correcte de la JNM présynaptique. Bien que des informations détaillées soient fournies pour analyser les JNM de TA et GA, en principe, ce protocole pourrait être adapté à d’autres muscles, y compris les muscles plats, tels que le diaphragme ou les abdominaux transversaux37, qui ne nécessitent pas l’étape de taquinerie. La fixation tissulaire est également cruciale pour assurer une coloration de bonne qualité; par conséquent, il est recommandé d’utiliser du PFA de haute qualité à un volume approprié (15 à 20 fois celui du muscle). En outre, le temps d’exposition au fixateur est une étape importante car des artefacts, tels que le retrait et l’agglutination, peuvent apparaître en raison d’une fixation excessive et influencer les caractéristiques de la JNM. Compte tenu de la taille des échantillons et du taux de pénétration de la solution de paraformaldéhyde dans les tissus38, un temps de fixation de 18-24 h est recommandé pour ce type de muscle. Dans le cas où l’étape de coloration est prévue plus d’une semaine après le prélèvement des tissus, il est suggéré de garder les muscles fixés au PFA dans le PBS supplémenté en azoture de sodium à 4 ° C pour prévenir la prolifération bactérienne.
Ce protocole présente une approche utilisant α-BTX-F488 pour la confocale et α-BTX-F633 pour l’imagerie STED. Ces fluorophores ont été choisis pour s’adapter à la conception expérimentale décrite, mais peuvent être modifiés en fonction de l’équipement et des matériaux disponibles. Par exemple, l’étiquetage α-BTX F488 peut être sélectionné lors de l’utilisation d’un laser STED CW 592 nm pour l’acquisition et la quantification d’images. Cependant, il semble que la configuration qui a été appliquée dans la présente étude (STED à excitation pulsée fermée, épuisement de 775 nm) présente des performances et une meilleure résolution que d’autres approches, telles que STED39 à onde continue, ce qui la rend plus adaptée à l’application actuelle. Il est également important de sélectionner avec soin les réglages de puissance laser, en particulier pour STED (excitation et épuisement), car les caractéristiques d’un profil d’intensité ne peuvent pas être mesurées en cas de saturation, et donc tout signal saturé dans une image NMJ pourrait compromettre l’ensemble de l’analyse.
Ce flux de travail détaillé, y compris l’acquisition et l’analyse d’images à l’aide d’un logiciel de microscope et de macros ImageJ, a été développé pour faciliter l’analyse morphométrique NMJ autonome par microscopie confocale et STED à partir d’un seul muscle. Les flux de travail décrits précédemment pour l’analyse confocale NMJ, tels que NMJ-morph2 ou NMJ-Analyser14, ont ouvert la voie à la conception de méthodes semi-automatiques qui facilitent l’analyse morphologique des NMJ et les études comparatives. NMJ-morph (et sa version mise à jour aNMJ-morph15) est une plate-forme gratuite basée sur ImageJ qui utilise la projection d’intensité maximale pour mesurer 21 caractéristiques morphologiques, et NMJ-Analyser utilise un script développé en Python qui génère 29 paramètres pertinents à partir de l’ensemble de la structure 3D NMJ. Le seuillage manuel est la seule étape du traitement d’image dans ces deux méthodes qui nécessitent une analyse utilisateur. Ce protocole intégré détaille les étapes de préparation des tissus, d’acquisition d’images confocales 3D et de traitement basé sur ImageJ des NMJ de muscles squelettiques entiers et fournit un aperçu simplifié de cinq paramètres importants des plaques terminales postsynaptiques (volume, surface de projection maximale et tortuosité) et présynaptiques (occupation terminale axonale et accumulation de neurofilaments). Un paramètre supplémentaire de pertinence biologique, le schéma d’organisation AChR des plis jonctionnels postsynaptiques, a été incorporé pour l’analyse morphométrique à l’échelle nanométrique par microscopie STED à super-résolution (résolution 20-30 nm)40. Il est intéressant de noter que la préparation des tissus pour l’imagerie STED est plus simple que d’autres méthodes utilisées pour les études ultrastructurales NMJ, telles que la microscopie électronique à transmission conventionnelle (TEM)9, qui est une procédure plutôt complexe et longue qui nécessite un manipulateur qualifié afin d’obtenir des sections ultraminces de la région musculaire appropriée. En outre, les données quantitatives provenant de plis jonctionnels multiples peuvent être obtenues automatiquement à l’aide du logiciel associé à STED.
Ce protocole a été appliqué pour illustrer les défauts des JNM précédemment connus dans les muscles déficients en SMN et ColQ 20,36,41,42. Des changements communs ont été trouvés dans les deux modèles murins par microscopie confocale, tels qu’une diminution du volume de la plaque terminale postsynaptique, de la zone MIP et de la tortuosité relative, ainsi qu’une accumulation accrue de neurofilaments, tandis que certains résultats plus spécifiques (diminution de l’occupation de la NMJ) n’ont été observés que chez les souris SMA, comme indicateur du trafic de vésicules altérées36. Enfin, une augmentation de la distance et de la largeur de la bande AChR a été détectée dans ColQ-KO par l’analyse STED, qui sont des signes de défauts ultrastructuraux dans les plis jonctionnels postsynaptiques, comme observé précédemment par TEM20. Il est important de noter que ce protocole peut aider à une caractérisation morphologique plus approfondie des jonctions neuromusculaires au cours du développement, de l’entretien et dans diverses conditions pathologiques.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions le « Cœur de l’Imagerie et de la Cytométrie » de Généthon, ainsi que le service d’histologie, qui sont soutenus en partie par des fonds d’équipement de la Région Ile-de-France, du Conseil Général de l’Essonne, de la Genopole Recherche d’Evry, de l’Université d’Evry Val d’Essonne et de l’INSERM, France. Nous remercions également le Dr Rashmi Kothary d’avoir fourni la lignée de souris Smn 2B/2B (Université d’Ottawa, Canada) et le Dr Eric Krejci pour la lignée de souris ColQDex2/+ (inédite, Université de Paris, France). Nous remercions Guillaume Corre pour son soutien en analyse statistique. Les anticorps monoclonaux 2H3 (développés par Jessel, T.M. et Dodd, J.) et SV2 (développés par Buckley, K.M.) ont été obtenus à partir de la Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), créée par le NICHD des NIH et maintenue à l’Université de l’Iowa, Département de biologie, Iowa City, IA 52242. Ce travail a été soutenu par l’Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon), l’INSERM et l’Université d’Evry Val d’Essonne.
Buffers and Reagents | |||
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (F488) | Life Technologies, Thermofisher | A-11001 | |
Alexa Fluor 488 α-bungarotoxin (F488-a-BTX) | Life Technologies, Thermofisher | B13422 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (F594) | Life Technologies, Thermofisher | A-11032 | |
ATTO-633 α-bungarotoxin (F633-a-BTX) | Alomone Labs | B-100-FR | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
DAPI Fluoromount-G | Southern Biotech | 00-4959-52 | |
DPBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
Ethanol Absolute | VWR | 20821.296 | |
Immersion Oil, n = 1.518 | THORLABS | MOIL-10LF | Low autofluorescence |
Neurofilament (NF-M) antibody | DSHB | AB_531793 | |
Paraformaldehyde (PFA) | MERCK | 1.04005 | |
Synaptic vesicle glycoprotein 2 (SV2) antibody | DSHB | AB_2315387 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Materials | |||
Alnico Button cylindrical magnets | Farnell France | E822 | diameter of 19.1 mm with maximal pull of 1.9 Kg |
63x 1.4 NA magnitude oil immersion HCX Plan Apo CS objective | Leica Microsystems | ||
100x 1.4 NA HC PL APPO CS2 Objective | Zeiss | ||
Curved thin forceps-Moria iris forceps | Fine Science Tools | 11370-31 | |
Extra thin scissors – Vannas-Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15-003-08 | |
Fine serrated forceps | Euronexia | P-95-AA | |
Gel loading tip round 1-200 µL | COSTAR | 4853 | |
Leica laser-scanning confocal microscope TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
Leica Laser-scanning confocal microscope TCS SP8 Gated STED 775 nm | Leica Microsystems | ||
Lens Cleaning Tissue | Whatman (GE Healthcare) | 2105-841 | |
Medium serrated forceps | Euronexia | P-95-AB | |
Microscope cover glasses 24×50 nm No 1.5H 170±5 µm | Marienfield | 107222 | High precision |
Nunclon delta surface (12-well plates) | Thermo Scientific | 150628 | |
Nunclon delta surface (24-well plates) | Thermo Scientific | 142475 | |
Safeshield scalpel | Feather | 02.001.40.023 | |
Sharp-blunt scissors – fine Scissors – Martensitic Stainless Steel | Fine Science Tools | 14094-11 | |
Superfrost plus slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
Software | |||
GraphPad | Prism, San Diego (US) | Release N°6.07 | Statistical software |
ImageJ software | National Institutes of Health | Release N° 1.53f | |
Leica Application Suite X software | Leica Microsystems | Release N°3.7.2.2283 | Free microscope software available at https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/ |