Due metodi di peeling per l'isolamento dei compartimenti cellulari fotorecettori nella retina del topo per l'analisi delle proteine

Le cellule fotorecettrici a bastoncello, strettamente impacchettate nello strato più esterno della retina neurale, sono parte integrante della visione a luce fioca. Per funzionare come contatori di fotoni fedeli, le barre utilizzano una via di segnalazione basata sulla proteina G, chiamata fototrasduzione, per generare risposte rapide, amplificate e riproducibili alla cattura di singoli fotoni. Questa risposta alla luce alla fine innesca un cambiamento nella corrente sulla membrana plasmatica e viene successivamente segnalata al resto del sistema ^visivo1. Come suggerisce il nome, ogni cellula a bastoncello ha una forma distinta simile a un’asta e presenta una morfologia cellulare altamente polarizzata, costituita da un segmento esterno (OS), un segmento interno (IS), un corpo cellulare (CB) e un terminale sinaptico (ST). Ogni compartimento subcellulare ha specifici macchinari proteici (legati alla membrana e solubili), caratteristiche biomolecolari e complessi proteici che svolgono ruoli cruciali come la fototrasduzione visiva, la pulizia generale e la sintesi proteica e la trasmissione ^sinaptica2,3.

Oltre 30 anni fa, il movimento reciproco dipendente dalla luce delle proteine subcellulari, in particolare la trasducina (lontano dalla OS) e l’arrestina (verso la OS), è stato osservato per la prima ^volta4,5,6,7. All’inizio, questo fenomeno osservato è stato accolto con scetticismo, dovuto in parte alla vulnerabilità dell’immunoistochimica al mascheramento dell’epitopo8. Nei primi anni 2000, la traslocazione proteica dipendente dallo stimolo è stata confermata utilizzando una rigorosa e ardua tecnica di sezionamento ^fisico9. Il sezionamento tangenziale seriale della retina di roditore piatta congelata seguito da immunoblotting ha rivelato che la ^{transtracina9,10}, l’arrestina11,12 e la ^recuperina13 subiscono tutte una ridistribuzione subcellulare in risposta alla luce. Si ritiene che la traslocazione guidata dalla luce di queste proteine chiave di segnalazione non solo regoli la sensibilità della cascata di fototrasduzione9,14,15, ma possa anche essere neuroprotettiva contro i danni alla luce16,17,18. Poiché il trasporto di proteine guidato dalla luce nelle barre sembra essere molto significativo per la biologia e la fisiologia delle cellule dei bastoncelli, le tecniche che consentono l’isolamento di diversi compartimenti subcellulari per determinare la distribuzione delle proteine sono preziosi strumenti di ricerca.

Attualmente, ci sono alcuni metodi volti a isolare i compartimenti subcellulari dell’asta. Tuttavia, questi metodi possono essere lunghi e difficili da riprodurre, o richiedono una quantità considerevole di isolato retinico. I preparati del segmento esterno dell’asta (ROS) tramite centrifugazione a gradiente di ^densità19, ad esempio, sono comunemente usati per separare il ROS dall’omogeneizzato retinico. Questo metodo è ampiamente utilizzato per western blot, ma la procedura richiede molto tempo e richiede un minimo di 8-12 retina ^murina20. D’altra parte, il sezionamento tangenziale seriale della retina murina e di ratto congelata è stato implementato con successo nell’isolamento del sistema operativo, IS, CB e ST9,11,13. Tuttavia, questo metodo è tecnicamente impegnativo a causa della necessità di appiattire completamente la retina murina piccola e altamente curva per allineare gli strati retinici prima della sezione tangenziale. Poiché ci sono una pletora di modelli murini e topi transgenici che ricapitolano le malattie del sistema visivo, la creazione di una tecnica che separa in modo affidabile, rapido e facile i singoli compartimenti delle aste è promettente nel rivelare i processi fisiologici che si verificano in ciascun compartimento specializzato e i meccanismi che sono alla base dei processi visivi in salute e malattia.

Per facilitare queste indagini, descriviamo due metodi di peeling che isolano i compartimenti subcellulari delle aste più facilmente rispetto ai protocolli attuali. Il primo metodo di peeling, adattato da una tecnica per esporre cellule bipolari marcate fluorescentemente per la registrazione del patch ^clamp21, impiega carta da filtro in cellulosa per rimuovere sequenzialmente il ROS da una retina murina isolata e viva (Figura 1). Il secondo metodo, adattato da una procedura che isola i tre strati primari di cellule retiniche da una retina ^chick22 e ^frog23, utilizza nastro adesivo per rimuovere il ROS e il segmento interno dell’asta (RIS) da una retina liofilizzata (Figura 2). Entrambe le procedure possono essere completate in 1 ora e sono notevolmente facili da usare. Forniamo la convalida dell’efficacia di questi due protocolli di separazione per western blot utilizzando retina adattata al buio ed esposta alla luce da topi C57BL / 6J per dimostrare la traslocazione indotta dalla luce di transducina rod (GNAT1) e arrestina (ARR1). Inoltre, utilizzando il metodo di peeling del nastro, forniamo ulteriori prove che la nostra tecnica può essere utilizzata per esaminare e affrontare le incongruenze tra i dati di localizzazione delle proteine acquisiti dall’immunocitochimica (ICC) e i western blots. Nello specifico, la nostra tecnica ha dimostrato che: 1) l’isoforma della proteina chinasi C-alfa (PKCα) è presente non solo nelle cellule bipolari, ma anche nei ROS murini e nei RIS, anche se in basse ^{concentrazioni24,25}, e 2) la rodopsina chinasi (GRK1) è presente prevalentemente nel campione isolato di OS. Questi dati dimostrano l’efficacia delle nostre due tecniche di peeling per separare e quantificare specifiche proteine del bastoncello e della retina.