Inmunofluorescencia de ovario completo, limpieza y microscopía multifotónica para el análisis cuantitativo en 3D de la reserva ovárica en desarrollo en ratones

La mayoría de las hembras de mamíferos nacen con un número finito de ovocitos detenidos meóicamente almacenados dentro de los folículos primordiales, constituyendo la reserva ovárica (OR)^1,2. El quirófano determina la esperanza de vida reproductiva y la salud reproductiva femenina en general³. El quirófano normalmente disminuye de tamaño con el envejecimiento y puede agotarse prematuramente tras la exposición a ciertos agentes genotóxicos (radiación/quimioterapia) y estrés ambiental (desnutrición), lo que lleva a la infertilidad ^4,5,6. La infertilidad femenina idiopática a menudo se puede atribuir a la calidad genética y fisiológica de los óvulos que se desarrollan a partir del quirófano y sigue siendo poco conocida ^7,8. Debido a que la dotación del folículo femenino está en gran medida predeterminada por el nacimiento, es esencial comprender los mecanismos reguladores involucrados en el establecimiento y mantenimiento del quirófano.

En ratones, la formación de QUIR comienza con la especificación de células germinales primordiales (PGC) alrededor del día embrionario (E) 7.5². Los PGC migran a las crestas genitales, donde residirán aproximadamente en E10.5⁹. La siguiente proliferación extensa ocurre con citocinesis incompleta que resulta en la formación de quistes que se descompondrán más adelante en el desarrollo^10,11. Aproximadamente en E12.5, se determina el sexo gonadal y la proliferación de PGC se detiene en los ovarios. En las mujeres, los PGC, ahora ovocitos, entran en la profase I meiótica (IPM) en aproximadamente E13,5 ^12,13. Los ovocitos progresan a través de un IPM extendido y se detienen en la etapa de dictyate alrededor del momento del nacimiento. Durante la primera semana después del nacimiento, cada ovocito detenido está rodeado de células de granulosa, formando así un folículo primordial.

El número de folículos primordiales en el quirófano de una hembra depende de cuántos ovocitos sobrevivieron a las ondas de eliminación de ovocitos que ocurren antes y durante la detención de MPI a través de apoptosis, autofagia o necrosis^14,15. La primera ola ocurre durante el desarrollo fetal y se conoce como FOA. La FOA es un proceso conservado evolutivamente en hembras (mamíferos y no mamíferos), por el cual se estima que el 50-80% de los ovocitos se eliminan dependiendo de la especie femenina 16,17,18,19. En ratones, la FOA ocurre durante E15.5 a E18.5 y se ha atribuido a la reactivación y expresión de secuencias de retrotransposones LINE-1 causando la muerte de ovocitos^20,21. La segunda ola de eliminación de ovocitos se produce a través de un punto de control meiótico que elimina ovocitos con defectos meióticos como roturas de doble cadena de ADN no reparadas (DSB)^22,23. La siguiente ola de eliminación de ovocitos ocurre durante la descomposición del quiste, culminando durante la formación de folículos primordiales, cada uno de los cuales contiene un solo ovocito 10,11,24,25.

En ratones, la reserva del folículo primordial se establece en gran medida por la pubertad, después de lo cual disminuye a medida que los folículos primordiales se activan para el crecimiento durante los ciclos reproductivos regulares. El tamaño del quirófano varía entre las mujeres individuales y entre las diferentes cepas genéticas de ratones; sin embargo, la regulación genética del tamaño del quirófano no se entiende bien ^26,27,28,29. Los estudios genéticos de la regulación del quirófano se ven obstaculizados por la falta de protocolos estandarizados para estudiar las ondas de eliminación de ovocitos durante el desarrollo prenatal y postnatal. Se han desarrollado varias metodologías de cuantificación de ovocitos en ratones, siendo la más común y ampliamente utilizada la evaluación histomorfométrica de las secciones histológicas^30,31. En esta técnica, los ovocitos se identifican en secciones seriadas con tinciones histológicas, como hematoxilina y eosina (H&E) y ácido-Schiff periódico (PAS) o marcadores fluorescentes. Esta técnica es confiable si todas las condiciones permanecen constantes, incluido el grosor de la sección, la recuperación eficiente de todas las secciones en todo el ovario y los esquemas de conteo de laboratorios individuales. Sin embargo, los números reportados por diferentes laboratorios a menudo difieren significativamente y, por lo tanto, no son fácilmente comparables.

Además, dadas las diferencias genéticas, el uso de diferentes cepas de ratón también puede influir en los recuentos de ovocitos. Se han desarrollado enfoques computacionales adicionales para la evaluación histomorfométrica e incluyen la detección automatizada de ovocitos utilizando el enfoque fraccionador, el conteo automático utilizando algoritmos computacionales y la reconstrucción 3D de imágenes histológicas para evitar recuentos múltiples del mismo ovocito 31,32,33,34,35,36 . Incluso con estas mejoras añadidas a la evaluación histomorfométrica, la técnica es relativamente laboriosa, particularmente para estudios a gran escala y de alto rendimiento. Los datos recopilados pueden no ser reproducibles y comparables entre los estudios debido a las diferencias en los esquemas de conteo, los algoritmos informáticos y el software utilizado.

Recientemente, acelerado por el desarrollo de nuevos métodos de microscopía multifotónica y de hoja de luz de resolución media y de limpieza óptica de tejidos, las técnicas de modelado y análisis 3D para ovarios intactos se están convirtiendo en el método de elección para cuantificar eficientemente el número de ovocitos y estudiar la localización y dinámica de proteínas^37,38. Estos métodos 3D suelen ser ventajosos en comparación con los métodos histológicos, ya que los tejidos y órganos se conservan mejor y se mantienen intactos. Además, el análisis y el modelado 3D proporcionan información adicional sobre la función y las interacciones dentro y entre los nichos celulares o subestructuras dentro del órgano que pueden perderse en el análisis 2D.

El análisis 3D de órganos completos requiere la optimización de los protocolos de fijación, inmunotinción y limpieza óptica para órganos individuales, como los ovarios, sin distorsión o daño tisular. Se requiere una optimización adicional del montaje de muestras para imágenes para microscopía de alta resolución y puede depender de la plataforma de imágenes disponible. Finalmente, la imagen de todo el ovario intacto genera una gran cantidad de datos para análisis computacionales posteriores. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar métodos 3D estandarizados para contar ovocitos para estudios comparativos y en todas las etapas de desarrollo.

Este protocolo utiliza inmunotinción estándar y protocolos de limpieza previamente informados, centrándose en un enfoque simple, fácil de usar y de alto rendimiento 38,39,40,41. El protocolo está optimizado para analizar un gran número de ovarios prenatales y postnatales hasta el día 28 postnatal (P28) y diferentes tamaños de ovarios de diferentes antecedentes genéticos de ratón. Los pasos de inmunotinción son similares para todas las etapas; sin embargo, los protocolos de aclaramiento difieren para los ovarios puberales debido a su mayor tamaño, ScaleS4(0) y CUBIC para ovarios pequeños y grandes, respectivamente^40,41. Además, la perfusión de todo el cuerpo se realiza en ratones P28 antes de la fijación para prevenir la autofluorescencia de las células sanguíneas. Se construyó un microscopio multifotónico en la plataforma Leica DIVE/4Tune como alternativa a la microscopía de hojas de luz para adquirir imágenes, y se eligió el software de Visualización y Análisis 3D IMARIS con diversas herramientas analíticas para este protocolo. Este protocolo es fácil de seguir y menos práctico, por lo tanto, ahorra tiempo. Además, la cuantificación de ovocitos es relativamente rápida, dependiendo del tamaño del ovario y la disposición de los ovocitos.