אימונופלואורסצנציה של השחלה כולה, ניקוי ומיקרוסקופיה מרובת פוטון לניתוח תלת-ממדי כמותי של עתודת השחלות המתפתחות בעכבר

רוב נקבות היונקים נולדות עם מספר סופי של ביציות שנעצרו במיוטיות המאוחסנות בתוך זקיקים ראשוניים, המהוות את שמורת השחלות (OR)^1,2. ה- OR קובע את תוחלת החיים הכוללת של הרבייה הנשית ואת^{בריאותה 3}. ה-OR בדרך כלל יורד בגודלו עם ההזדקנות וניתן לרוקן אותו בטרם עת עם חשיפה לחומרים גנוטוקסיים מסוימים (הקרנות/כימותרפיה) ולחצים סביבתיים (תת-תזונה), מה שמוביל לאי פוריות ^4,5,6. לעתים קרובות ניתן לייחס אי פוריות נשית אידיופטית לאיכות הגנטית והפיזיולוגית של ביציות המתפתחות מה-OR ונשארות לא מובנות היטב ^7,8. מכיוון שהקדשת זקיק נקבה נקבעת במידה רבה מראש על ידי לידה, חיוני להבין את מנגנוני הרגולציה המעורבים בהקמה ובתחזוקה של OR.

בעכברים, היווצרות OR מתחילה במפרט של תאי נבט ראשוניים (PGCs) סביב היום העוברי (E) 7.5². המחשבים נודדים לרכסי איברי המין, שם הם ישכנו על ידי כ- E10.5⁹. ההתרבות הנרחבת הבאה מתרחשת עם ציטוקינזיזה לא שלמה וכתוצאה מכך נוצרות ציסטות שיתפרקו בהמשך ההתפתחות^10,11. בסביבות E12.5, נקבע מין גונדלי, והתפשטות PGC נעצרת בשחלות. אצל נקבות, מחשבים אישיים, כיום ביציות, נכנסים לפרופאזה מיוטית I (MPI) בסביבות E13.5^12,13. ביציות מתקדמות דרך MPI ממושך ונעצרות בשלב ההכתבה סביב זמן הלידה. במהלך השבוע הראשון לאחר הלידה, כל ביצית שנעצרה מוקפת בתאי גרנולוזה, ובכך יוצרת זקיק קדמוני.

מספר הזקיקים הבראשיתיים ב-OR של נקבה תלוי בכמה ביציות שרדו את גלי סילוק הביציות המתרחשים לפני ובמהלך מעצר MPI באמצעות אפופטוזיס, אוטופגיה או נמק^14,15. הגל הראשון מתרחש במהלך התפתחות העובר וידוע בשם FOA. FOA הוא תהליך שמור מבחינה אבולוציונית אצל נקבות (יונקים ולא יונקים), לפיו כ-50-80% מהביציות מסולקות בהתאם למין הנקבה ^16,17,18,19. בעכברים, FOA מתרחש במהלך E15.5 עד E18.5 ויוחס להפעלה מחדש ולביטוי של רצפי LINE-1 רטרו-טרנספוזונים הגורמים למוות של ביציות^20,21. הגל השני של חיסול ביציות מתרחש דרך מחסום מיוטי שמחסל ביציות עם פגמים מיוטיים כמו שברים דו-גדיליים של דנ”א שלא תוקן (DSBs)^22,23. הגל הבא של חיסול ביציות מתרחש במהלך התמוטטות ציסטה, ומגיע לשיאו במהלך היווצרות של זקיקים ראשוניים, שכל אחד מהם מכיל ביצית אחת 10,11,24,25.

בעכברים, עתודת הזקיקים הבראשיתית הוקמה במידה רבה על ידי גיל ההתבגרות, ולאחר מכן היא פוחתת כאשר זקיקים ראשוניים מופעלים לצמיחה במהלך מחזורי רבייה רגילים. גודל OR משתנה בין נשים בודדות ובין זנים גנטיים שונים של עכברים; עם זאת, הוויסות הגנטי של גודל OR אינו מובן היטב 26,27,28,29. מחקרים גנטיים של ויסות OR נפגעים על ידי היעדר פרוטוקולים סטנדרטיים לחקור את גלי חיסול הביציות במהלך התפתחות טרום לידתית ואחרי לידה. מספר מתודולוגיות לכימות ביציות פותחו בעכברים, כאשר הנפוצה והנפוצה ביותר היא הערכה היסטומורפיתמטרית של חלקים היסטולוגיים^30,31. בטכניקה זו, ביציות מזוהות בקטעים סדרתיים עם כתמים היסטולוגיים, כגון המטוקסילין ואוזין (H&E) וחומצה מחזורית-שיף (PAS) או סמנים פלואורסצנטיים. טכניקה זו אמינה אם כל התנאים נשארים קבועים, כולל עובי חתך, התאוששות יעילה של כל החלקים לאורך השחלה, ואת תוכניות הספירה של מעבדות בודדות. עם זאת, המספרים המדווחים על ידי מעבדות שונות לעתים קרובות שונים באופן משמעותי ולכן אינם ניתנים להשוואה בקלות.

יתר על כן, בהינתן הבדלים גנטיים, השימוש בזני עכברים שונים יכול גם להשפיע על ספירת הביציות. גישות חישוביות נוספות פותחו להערכה היסטומורפיתמטרית וכוללות זיהוי אוטומטי של ביציות באמצעות גישת השבר, ספירה אוטומטית באמצעות אלגוריתמים חישוביים ושחזור תלת-ממדי של תמונות היסטולוגיות כדי למנוע ספירות מרובות של אותה ביציה 31,32,33,34,35,36 . גם כאשר שיפורים אלה מתווספים להערכה היסטומומורפומטרית, הטכניקה היא יחסית עתירת עבודה, במיוחד עבור מחקרים בקנה מידה גדול ותפוקה גבוהה. ייתכן שהנתונים שנאספו לא יהיו ניתנים לשחזור ולהשוואה בין מחקרים בשל הבדלים בסכמות הספירה, באלגוריתמים הממוחשבים ובתוכנות שבהן נעשה שימוש.

לאחרונה, מואצת על ידי פיתוח של מיקרוסקופיית מולטיפוטונים ויריעות אור חדשות ברזולוציה בינונית ושיטות ניקוי רקמות אופטיות, טכניקות מידול וניתוח תלת-ממדיות לשחלות שלמות הופכות לשיטה המועדפת לכימות יעיל של מספרי ביציות וחקר לוקליזציה ודינמיקה של חלבונים^37,38. שיטות תלת-ממדיות אלה הן בדרך כלל יתרון בהשוואה לשיטות היסטולוגיות, שכן רקמות ואיברים נשמרים טוב יותר ונשמרים ללא פגע. יתר על כן, ניתוח ומידול תלת-ממדיים מספקים תובנות נוספות לגבי תפקוד ואינטראקציות בתוך ובין נישות תאים או תת-מבנים בתוך האיבר שעלולים להחמיץ בניתוח דו-ממדי.

ניתוח תלת-ממדי של איברים שלמים דורש אופטימיזציה של קיבוע, חיסון ופרוטוקולי ניקוי אופטיים עבור איברים בודדים, כגון שחלות, ללא עיוות או נזק לרקמות. אופטימיזציה נוספת של הרכבה לדוגמה להדמיה נדרשת למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה ועשויה להיות תלויה בפלטפורמת ההדמיה הזמינה. לבסוף, הדמיה של השחלה השלמה כולה מייצרת כמות גדולה של נתונים עבור ניתוחים חישוביים מאוחרים יותר. לכן, יש צורך לפתח שיטות תלת-ממדיות סטנדרטיות לספירת ביציות למחקרים השוואתיים ולשלבים התפתחותיים שונים.

פרוטוקול זה משתמש בפרוטוקולי סילוק חיסוני סטנדרטיים ודווחו בעבר, תוך התמקדות בגישה פשוטה, ידידותית למשתמש ותפוקה גבוהה 38,39,40,41. הפרוטוקול מותאם לניתוח מספר גדול של שחלות טרום לידתיות ואחרי לידה עד ליום 28 שלאחר הלידה (P28) וגדלים משתנים של שחלות מרקע גנטי שונה של עכברים. הצעדים החיסוניים דומים לכל השלבים; עם זאת, פרוטוקולי הסליקה שונים עבור שחלות ההתבגרות בשל גודלן הגדול יותר, ScaleS4(0) ו- CUBIC עבור שחלות קטנות וגדולות, בהתאמה^40,41. יתר על כן, זלוף של כל הגוף מבוצע בעכברי P28 לפני הקיבוע כדי למנוע אוטופלואורסצנציה מתאי הדם. מיקרוסקופ מולטי-פוטון נבנה על פלטפורמת Leica DIVE/4Tune כחלופה למיקרוסקופ יריעות אור כדי להשיג תמונות, ותוכנת ההדמיה והניתוח התלת-ממדית של IMARIS עם כלים אנליטיים שונים נבחרה לפרוטוקול זה. פרוטוקול זה פשוט למעקב ופחות מעשי, ומכאן חיסכון בזמן. יתר על כן, כימות הביציות הוא מהיר יחסית, בהתאם לגודל השחלה וסידור הביציות.