Preparación de muestras y cuantificación relativa mediante metilación reductiva de aminas para estudios de peptidómica

Las ciencias “ómicas” se caracterizan por el análisis profundo de un conjunto de moléculas, como ADN, ARN, proteínas, péptidos, metabolitos, etc. Estos conjuntos de datos generados a gran escala (genómica, transcriptómica, proteómica, peptidómica, metabolómica, etc.) han revolucionado la biología y han llevado a una comprensión avanzada de los procesos ^biológicos1. El término peptidómica comenzó a introducirse a principios del ^siglo 20, y algunos autores se han referido a él como una rama de la ^proteómica2. Sin embargo, la peptidómica tiene distintas particularidades, donde el interés principal es investigar el contenido de péptidos generados naturalmente durante los procesos celulares, así como la caracterización de la actividad biológica de estas ^{moléculas3,4}.

Inicialmente, los estudios de péptidos bioactivos se restringieron a los neuropéptidos y péptidos hormonales a través de la degradación de Edman y el radioinmunoensayo. Sin embargo, estas técnicas no permiten un análisis global, dependiendo del aislamiento de cada péptido en altas concentraciones, tiempo para la generación de anticuerpos, además de la posibilidad de reactividad ^cruzada5.

El análisis peptidómico solo fue posible después de varios avances en espectrometría de masas acoplada a cromatografía líquida (LC-MS) y proyectos de genoma que entregaron grupos de datos completos para estudios de proteómica / peptidómica6,7. Además, era necesario establecer un protocolo específico de extracción de péptidos para peptidomes porque los primeros estudios que analizaron neuropéptidos a nivel mundial en muestras cerebrales mostraron que la detección se vio afectada por la degradación masiva de proteínas, que ocurren principalmente en este tejido después de 1 min post mortem. La presencia de estos fragmentos peptídicos enmascaró la señal del neuropéptido y no representó el peptidomo in vivo. Este problema se resolvió principalmente con la aplicación de la inactivación por calentamiento rápido de proteasas mediante irradiación por microondas, lo que redujo drásticamente la presencia de estos fragmentos de artefactos y permitió no solo la identificación de fragmentos de neuropéptidos sino que reveló la presencia de un conjunto de péptidos a partir de proteínas citosólicas, mitocondriales y nucleares, diferentes de degradome6,8,9.

Estos procedimientos metodológicos permitieron una expansión del peptídomo más allá de los conocidos neuropéptidos, donde se han identificado cientos de péptidos intracelulares generados principalmente por la acción de proteasomas en ^levaduras10, pez ^cebra11, tejidos de ^roedores12 y células ^humanas13. Se ha demostrado ampliamente que decenas de estos péptidos intracelulares tienen actividades biológicas y farmacológicas14,15. Además, estos péptidos pueden ser utilizados como biomarcadores de la enfermedad y posiblemente tener importancia clínica, como se demuestra en el líquido cefalorraquídeo de pacientes con aneurismas sacculares ^{intracraneales16}.

Actualmente, además de la identificación de secuencias peptídicas, es posible a través de la espectrometría de masas obtener datos de cuantificación absoluta y relativa. En la cuantificación absoluta, los niveles de péptidos en una muestra biológica se comparan con los estándares sintéticos, mientras que en la cuantificación relativa, los niveles de péptidos se comparan entre dos o más ^muestras17. La cuantificación relativa se puede realizar utilizando los siguientes enfoques: 1) “libre de etiquetas”¹⁸; 2) etiquetado metabólico in vivo o 3) etiquetado químico. Los dos últimos se basan en el uso de formas isotópicas estables incorporadas a ^{péptidos19,20}. En el análisis sin etiquetas, los niveles de péptidos se estiman considerando la intensidad de la señal (recuentos espectrales) durante el ^LC-MS18. Sin embargo, el etiquetado isotópico puede obtener niveles relativos más precisos de péptidos.

Muchos estudios peptidómicos utilizaron reactivos de etiquetado de butirato de trimetilamonio (TMAB) como etiquetado químico, y más recientemente, se ha utilizado la metilación reductiva de aminas (RMA) con formas deuteradas y no deuteradas de formaldehído y reactivos de cianoborohidruro de sodio11,21,22. Sin embargo, las etiquetas TMAB no están disponibles comercialmente, y el proceso de síntesis es muy laborioso. Por otro lado, en el RMA, los reactivos están disponibles comercialmente, son baratos en comparación con otras etiquetas, el procedimiento es simple de realizar y los péptidos etiquetados son ^{estables23,24}.

El uso de RMA implica la formación de una base de Schiff al permitir que los péptidos reaccionen con el formaldehído, seguido de una reacción de reducción a través del cianoborohidruro. Esta reacción provoca dimetilación de los grupos amino libres en las cadenas laterales N-terminales y lisina y monometilatos N-terminales prolinas. Como los residuos de prolina son a menudo raros en el N-terminal, prácticamente todos los péptidos con aminas libres en el N-terminal están marcados con dos grupos metilo23,24,25^.