Пробоподготовка и относительное количественное определение с использованием восстановительного метилирования аминов для исследований пептидомики

«Омические» науки характеризуются глубоким анализом набора молекул, таких как ДНК, РНК, белки, пептиды, метаболиты и т.д. Эти крупномасштабные наборы данных (геномика, транскриптомика, протеомика, пептидомика, метаболомика и т. д.) произвели революцию в биологии и привели к продвинутому пониманию биологических ^{процессов1}. Термин пептидомика начал вводиться в начале 20 ^века, и некоторые авторы называли его ветвью протеомики2. Однако пептидомика имеет отличительные особенности, где основной интерес заключается в исследовании содержания естественно генерируемых пептидов в ходе клеточных процессов, а также характеристике биологической активности этих ^{молекул3,4}.

Первоначально исследования биологически активных пептидов были ограничены нейропептидами и гормональными пептидами через деградацию Эдмана и радиоиммуноанализ. Однако эти методики не позволяют провести глобальный анализ, в зависимости от выделения каждого пептида в высоких концентрациях, времени генерации антител, кроме возможности перекрестной ^{реактивности5}.

Анализ пептидомики стал возможен только после нескольких достижений в области жидкостной хроматографии, связанной с масс-спектрометрией (LC-MS) и проектами генома, которые предоставили комплексные пулы данных для исследований протеомики / ^{пептидомики6,7}. Кроме того, необходимо было установить специфический протокол экстракции пептидов для пептидов, потому что первые исследования, которые анализировали нейропептиды в глобальном масштабе в образцах мозга, показали, что на обнаружение влияет массивная деградация белков, которая происходит в основном в этой ткани через 1 мин после вскрытия. Присутствие этих пептидных фрагментов маскировало сигнал нейропептида и не представляло собой пептидом in vivo. Эта проблема решалась в основном применением быстрой нагревательной инактивации протеаз с помощью микроволнового облучения, что резко уменьшило присутствие этих фрагментов артефактов и позволило не только идентифицировать фрагменты нейропептидов, но и выявило наличие набора пептидов из цитозольных, митохондриальных и ядерных белков, отличающихся от деградома6,8,9.

Эти методологические процедуры позволили расширить пептидом за пределы известных нейропептидов, где сотни внутриклеточных пептидов, генерируемых главным образом действием протеасом, были идентифицированы в дрожжах10, рыбках данио11, тканях грызунов12 и клетках ^{человека13}. Было широко показано, что десятки этих внутриклеточных пептидов обладают как биологической, так и фармакологической ^{активностью14,15}. Кроме того, эти пептиды могут быть использованы в качестве биомаркеров заболевания и, возможно, имеют клиническое значение, как показано в спинномозговой жидкости у пациентов с внутричерепными мешковидными аневризмами16.

В настоящее время, помимо идентификации пептидных последовательностей, можно с помощью масс-спектрометрии получить данные абсолютного и относительного количественного определения. В абсолютном количественном определении уровни пептидов в биологическом образце сравниваются с синтетическими стандартами, в то время как в относительном количественном определении уровни пептидов сравниваются между двумя или более ^{образцами17}. Относительное количественное определение может быть выполнено с использованием следующих подходов: 1) «без меток»¹⁸; 2) метаболическая маркировка in vivo или 3) химическая маркировка. Последние два основаны на использовании стабильных изотопных форм, включенных в ^{пептиды19,20}. В анализе без меток уровни пептидов оцениваются с учетом силы сигнала (спектральных показателей) во время ^LC-MS18. Однако изотопная маркировка может получить более точные относительные уровни пептидов.

Во многих пептидомических исследованиях в качестве химической маркировки использовался триметиламмоний бутират (TMAB), а в последнее время было использовано восстановительное метилирование аминов (RMA) с дейтерированными и невейтерированными формами формальдегида и реагентов цианоборогидрида натрия11,21,22. Однако этикетки TMAB коммерчески недоступны, а процесс синтеза очень трудоемкий. С другой стороны, в RMA реагенты коммерчески доступны, недороги по сравнению с другими этикетками, процедура проста в выполнении, а меченые пептиды ^{стабильны23,24}.

Использование RMA включает в себя формирование основания Шиффа, позволяя пептидам реагировать с формальдегидом с последующей реакцией восстановления через цианоборогидрид. Эта реакция вызывает диметилирование свободных аминогрупп на N-концевых и лизиновых боковых цепях и монометилатах N-концевых пролинов. Поскольку остатки пролина часто редки на N-конце, практически все пептиды со свободными аминами на N-конце помечены двумя метильными группами23,24,25^.