Özet

펩티도믹스 연구를 위한 아민의 환원 메틸화를 이용한 샘플 준비 및 상대적 수량

Published: November 04, 2021
doi:

Özet

이 문서에서는 열 불활성화를 기반으로 한 시료 준비 방법을 설명하여 내인성 펩티드를 보존하여 분해 후 모독을 피하고, 동위원소 라벨링과 LC-MS를 사용하여 상대적 수량을 유지합니다.

Abstract

펩티도믹스는 생물학적 샘플에서 펩타이드의 정성적 및 정량적 분석으로 정의될 수 있다. 주요 응용 분야에는 질병 또는 환경 스트레스의 펩티드 바이오마커 를 식별하고, 신경 펩티드, 호르몬 및 생리 활성 세포 내 펩티드를 식별하고, 단백질 가수분해제에서 항균 및 영양 펩티드를 발견하고, 프로테올리틱 프로세스를 이해하는 연구에 사용될 수 있습니다. 최근 시료 제제, 분리 방법, 질량 분석 기술 및 단백질 시퀀싱과 관련된 계산 도구의 사전은 확인된 펩티드 수 및 펩티돔의 증가에 기여하였다. 펩티도믹 연구는 세포에서 자연적으로 발생하는 펩티드를 자주 분석합니다. 여기서, 열불활성화에 기초한 샘플 준비 프로토콜이 기재되어 프로테아제 활성을 제거하고 온화한 조건으로 추출하므로 펩티드 결합 분열이 없다. 또한, 아민의 환원 메틸화에 의한 안정적인 동위원소 라벨링을 이용한 펩타이드의 상대적 양도 도시된다. 이 라벨링 방법은 시약이 시판되고, 다른 사람에 비해 저렴하고, 화학적으로 안정적이며, 단일 LC-MS 실행에서 최대 5개의 시료를 분석할 수 있기 때문에 몇 가지 장점이 있다.

Introduction

“Omics” 과학은 DNA, RNA, 단백질, 펩타이드, 대사 산물 등과 같은 분자 세트의 심층 분석을 특징으로 합니다. 이러한 생성된 대규모 데이터 세트(유전체학, 전사학, 프로테오믹스, 펩티도믹스, 메타볼로믹스 등)는 생물학에 혁명을 일으켰으며 생물학적 과정에 대한 고급 이해로 이어졌다1. 용어 펩티도믹스는 20 세기 초에 소개되기 시작하고, 몇몇 저자는 proteomics2의 분기로 그것을 언급했습니다. 그러나, 펩티도믹스는 세포 과정 동안 자연적으로 생성된 펩티드 함량뿐만 아니라 이들 분자의 생물학적 활성의 특성화를 조사하는 것이 주요 관심사인 뚜렷한 특수성을 갖는다3,4.

처음에, 생리 활성 펩티드 연구는 에드먼 분해 및 방사선 면역을 통해 신경 펩티드와 호르몬 펩티드에 제한되었다. 그러나, 이들 기술은 고농도각 펩티드의 절연에 따라, 항체의 생성을 위한 시간, 교차 반응성 가능성 외에 글로벌 분석을 허용하지 않는다5.

펩티도믹스 분석은 프로테오믹스/펩티도믹스 연구를 위한 포괄적인 데이터 풀을 전달한 액체 크로마토그래피 결합 질량 분광법(LC-MS) 및 게놈 프로젝트에서 몇 차례 발전한 후에만 가능하였다6,7. 더욱이, 펩티돔에 대한 특정 펩티드 추출 프로토콜은 뇌 샘플에서 전 세계적으로 신경펩티드를 분석한 첫 번째 연구결과에 따라 검출이 단백질의 대규모 분해에 의해 영향을 받았기 때문에 확립될 필요가 있었으며, 이는 주로 이 조직에서 발생하며, 이는 사후 1분 후에 주로 발생한다. 이러한 펩티드 단편의 존재는 신경 펩티드 신호를 마스크하고 생체 내펩티돔을 나타내지 않았다. 이 문제는 주로 전자 레인지 조사를 사용하여 프로테아제의 빠른 가열 불활성화의 적용으로 해결되었으며, 이는 이러한 유물 조각의 존재를 크게 감소시키고 신경 펩티드 조각의 식별뿐만 아니라 세포세포, 미토콘드리아 및 핵 단백질의 존재를 드러냈으며, 데그라돔6,8,9의 다른.

이러한 방법론적 절차는 잘 알려진 신경 펩티드를 넘어 펩티돔의 확장을 허용했으며, 프로테좀의 작용에 의해 주로 생성된 수백 개의 세포내 펩타이드가 효모10, 제브라피시11, 설치류 조직12 및 인간 세포13에서 확인되었다. 이러한 세포 내 펩티드의 수십 광범위하게 생물학적 및 약리학적 활동을 모두 가지고 표시되었습니다14,15. 더욱이, 이들 펩타이드는 질병 바이오마커로 사용될 수 있으며, 두개내 실동맥류16환자로부터 뇌척수액에서 입증된 바와 같이 임상적 중요성을 가질 수 있다.

현재, 펩티드 서열의 식별 외에도 질량 분석법을 통해 절대 및 상대적 수량의 데이터를 얻을 수 있다. 절대 수량에서, 생물학적 샘플의 펩티드 수준은 합성 표준과 비교되며, 상대적 수량에서 펩티드 수준은 2개 이상의 샘플 중에서 비교된다17. 상대적 수량은 다음 방법을 사용하여 수행 할 수 있습니다 : 1) “레이블 무료”18; 2) 생체 내 대사 라벨링 또는 3) 화학 라벨링. 마지막 두 펩티드19,20에 통합된 안정적인 동위원소 형태의 사용을 기반으로 한다. 라벨프리 분석에서 펩타이드 수준은 LC-MS18 동안 신호 강도(스펙트럼 수)를 고려하여 추정된다. 그러나, 동위원소 라벨링은 펩티드의 보다 정확한 상대적 수준을 얻을 수 있다.

많은 펩티도믹 연구는 트리메틸람모늄 부티레이트(TMAB)를 화학 라벨링으로 라벨링하는 시약을 사용했으며, 최근에는 포름알데히드와 시아노보하이드라이드 나트륨 시약의 유정 및 비유화 된 형태를 가진 아민 (RMA)의 환원 메틸화를 사용했습니다111,21,22. 그러나, TMAB 라벨은 상업적으로 사용할 수 없으며, 합성 과정은 매우 힘들다. 한편, RMA에서 시약은 시판되고, 다른 라벨에 비해 저렴하며, 절차는 수행하기가 간단하며, 표지된 펩타이드는 안정23,24이다.

RMA의 사용은 펩티드가 포름알데히드와 반응할 수 있도록 함으로써 쉬프 기지를 형성하는 것을 포함하고, 그 다음에 시아노보로하이드라이드를 통해 환원 반응에 선행됩니다. 이 반응은 N 단자 및 리신 사이드 체인및 단백석 N 단자 프롤라인에 무료 아미노 그룹의 디메틸화를 일으킵니다. 프롤린 잔류물이 N 단자에서 자주 드물며, N-terminus에 무료 아민이 있는 거의 모든 펩타이드는 두 개의 메틸 군23,24,25로 표시된다.

Protocol

펩티드 추출 및 환원 메틸화를 위한 다음 절차는 이전에 발표된 절차24,25,26,27에서 조정되었다. 이 프로토콜은 국립 동물 실험 통제 위원회 (CONCEA)의 지침을 따랐으며 상파울루 주립 대학의 생물 과학 연구소에서 동물 사용 윤리위원회 (CEUA)의 승인을 받았습니다. 프로토콜 단계는 그림 …

Representative Results

질량 분광계에서 수행된 실행에서 얻은 결과는 질량 분광계 소프트웨어에서 열 수 있는 원시 데이터 파일에 저장됩니다. MS 스펙트럼에서, 2-5 라벨에 이르기까지 사용되는 라벨링 방식에 따라 표지된 펩티드를 나타내는 피크 그룹을 관찰할 수 있다. 예를 들어 그림 2에서 크로마토그래피 시간에서 검출된 피크 쌍은 동일한 실행에서 두 개의 동위원소 레이블만 사용된 실험에…

Discussion

대부분의 펩티도믹스 연구에서, 중요한 단계 중 하나는 의심할 여지없이, 몇 분 후 프로테아제에 의해 생성 된 펩티드 단편의 존재를 피하기 위해 신중하게 수행해야하는 샘플 준비입니다. 비전자래드 샘플에서 제조된 뇌 추출물에 대한 초기 연구는 10kDa 마이크로필로테스에 존재하는 많은 단백질 단편을 보여주었다. 단백질 분해로부터 펩티드 스펙트럼을 피하기 위해 다른 접근법이 설명되었습?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

여기에 설명 된 기술의 개발 및 사용은 브라질 국가 연구위원회 보조금 420811/2018-4 (LMC)에 의해 지원되었다; Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) 교부금 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) 및 21/01286-1 (MEME). 기금은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 게시 결정 또는 문서 작성에 아무런 역할이 없었습니다.

Materials

10 kDa cut-off filters Merck Millipore UFC801024 Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10 kDa
Acetone Sigma-Aldrich 179124
Acetonitrile Sigma-Aldrich 1000291000
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 11213
analytical column (EASY-Column) EASY-Column (SC200)  10 cm, ID75 µm, 3 µm, C18-A2
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate Sigma-Aldrich E10521 MS-222
Fluorescamine Sigma-Aldrich F9015
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich 252549
Formaldehyde-13C, d2, solution Sigma-Aldrich 596388
Formaldehyde-d2 solution Sigma-Aldrich 492620
Formic acid Sigma-Aldrich 33015
Fume hood Quimis Q216
Hydrochloric acid – HCl Sigma-Aldrich 258148
LoBind-Protein retention tubes Eppendorf EP0030108116-100EA
LTQ-Orbitrap Velos Thermo Fisher Scientific LTQ Velos
Microwave oven Panasonic NN-ST67HSRU
n Easy-nLC II nanoHPLC Thermo Fisher Scientific LC140
PEAKS Studio Bioinformatics Solutions Inc. VERSION 8.5
Phosphate-buffered saline Invitrogen 3002 tablets
precolumn (EASY-Column) Thermo Fisher Scientific (SC001) 2 cm, ID100 µm, 5 µm, C18-A1
Refrigerated centrifuge Hermle Z326K for conical tubes
Refrigerated centrifuge Vision VS15000CFNII for microtubes
Reversed-phase cleanup columns   (Oasis HLB 1 cc Cartridge) Waters 186000383 Oasis HLB 1 cc Cartridge
Sodium cyanoborodeuteride – NaBD3CN Sigma-Aldrich 190020
Sodium cyanoborohydride – NaBH3CN Sigma-Aldrich 156159
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S9763 NOTE: 0.2 M PB= 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (26.85 mL of Na2HPO3 1M) plus 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (23.15 mL of NaH2PO3 1M) to 250 ml of water
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S3139
Sonicator Qsonica Q55-110
Standard peptide Proteimax amino acid sequence: LTLRTKL
Triethylammonium buffer – TEAB 1 M Sigma-Aldrich T7408
Trifluoroacetic acid – TFA Sigma-Aldrich T6508
Ultra purified water Milli-Q Direct-Q 3UV
Vacuum centrifuge GeneVac MiVac DNA concentrator
Water bath Cientec 266
Xcalibur Software ThermoFisher Scientific OPTON-30965

Referanslar

  1. Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J. The era of ‘omics unlimited. Biotechniques. 46 (5), 354-355 (2009).
  2. Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A. Plant peptides and peptidomics. Plant Biotechnology Journal. 6 (2), 105-134 (2008).
  3. Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D. The peptidomics concept. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 8 (8), 697-704 (2005).
  4. Dallas, D. C., et al. Current peptidomics: applications, purification, identification, quantification, and functional analysis. Proteomics. 15 (5-6), 1026-1038 (2015).
  5. Chard, T. An introduction to radioimmunoassay and related techniques (3rd Ed). FEBS Letters. 238 (1), 223 (1988).
  6. Svensson, M., Sköld, K., Svenningsson, P., Andren, P. E. Peptidomics-based discovery of novel neuropeptides. Journal of Proteome Research. 2 (2), 213-219 (2003).
  7. Baggerman, G., et al. Peptidomics. Journal of Chromatography B. 803, 3-16 (2004).
  8. Theodorsson, E., Stenfors, C., Mathe, A. A. Microwave irradiation increases recovery of neuropeptides from brain tissues. Peptides. 11, 1191-1197 (1990).
  9. Che, F. Y., Lim, J., Pan, H., Biswas, R., Fricker, L. D. Quantitative neuropeptidomics of microwave-irradiated mouse brain and pituitary. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 1391-1405 (2005).
  10. Dasgupta, S., et al. Analysis of the yeast peptidome and comparison with the human peptidome. PLoS One. 11 (9), 0163312 (2016).
  11. Teixeira, C. M. M., Correa, C. N., Iwai, L. K., Ferro, E. S., Castro, L. M. Characterization of Intracellular Peptides from Zebrafish (Danio rerio) Brain. Zebrafish. 16 (3), 240-251 (2019).
  12. Fricker, L. D. Analysis of mouse brain peptides using mass spectrometry-based peptidomics: implications for novel functions ranging from non-classical neuropeptides to microproteins. Molecular BioSystems. 6 (8), 1355-1365 (2010).
  13. Gelman, J. S., Sironi, J., Castro, L. M., Ferro, E. S., Fricker, L. D. Peptidomic analysis of human cell lines. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1583-1592 (2011).
  14. De Araujo, C. B., et al. Intracellular peptides in cell biology and pharmacology. Biomolecules. 9, 150 (2019).
  15. Gewehr, M. C. F., Silverio, R., Rosa-Neto, J. C., Lira, F. S., Reckziegel, P., Ferro, E. S. Peptides from natural or rationally designed sources can be used in overweight, obesity, and type 2 diabetes therapies. Molecules. 25 (5), 1093 (2020).
  16. Sakaya, G. R., et al. Peptidomic profiling of cerebrospinal fluid from patients with intracranial saccular aneurysms. Journal of Proteomics. 240 (3), 104188 (2021).
  17. Fricker, L. Quantitative peptidomics: General considerations. Methods in Molecular Biology. 1719, 121-140 (2018).
  18. Southey, B. R., et al. Comparing label-free quantitative peptidomics approaches to characterize diurnal variation of peptides in the rat suprachiasmatic nucleus. Analytical Chemistry. 86 (1), 443-452 (2014).
  19. Chen, X., Wei, S., Ji, Y., Guo, X., Yang, F. Quantitative proteomics using SILAC: Principles, applications, and developments. Proteomics. 15 (18), 3175-3192 (2015).
  20. Boonen, K., et al. Quantitative peptidomics with isotopic and isobaric tags. Methods in Molecular Biology. 1719, 141-159 (2018).
  21. Gewehr, M. C. F., et al. The relevance of thimet oligopeptidase in the regulation of energy metabolism and diet-induced obesity. Biomolecules. 10 (2), 321 (2020).
  22. Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model. Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).
  23. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
  24. Dasgupta, S., Castro, L. M., Tashima, A. K., Fricker, L. Quantitative peptidomics using reductive methylation of amines. Methods in Molecular Biology. 1719, 161-174 (2018).
  25. Tashima, A. K., Fricker, L. D. Quantitative peptidomics with five-plex reductive methylation labels. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 866-878 (2018).
  26. Che, F. Y., et al. Optimization of neuropeptide extraction from the mouse hypothalamus. Journal of Proteome Research. 6 (12), 4667-4676 (2007).
  27. Lyons, P. J., Fricker, L. D. Peptidomic approaches to study proteolytic activity. Current Protocols in Protein Science. , 13 (2011).
  28. Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: a reagent for assay of amino acids, peptides, proteins, and primary amines in the picomole range. Science. 178 (4063), 871-872 (1972).
  29. Ma, B., et al. PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (20), 2337-2342 (2003).
  30. Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (4), 1-8 (2012).
  31. Sturm, R. M., Dowell, J. A., Li, L. Rat brain neuropeptidomics: tissue collection, protease inhibition, neuropeptide extraction, and mass spectrometric analysis. Methods in Molecular Biology. 615, 217-226 (2010).
  32. Fricker, L. D. Limitations of mass spectrometry-based peptidomic approaches. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (12), 1981-1991 (2015).
  33. Ross, , et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & Cellular Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
  34. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).

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Bu Makaleden Alıntı Yapın
Correa, C. N., Fiametti, L. O., Mazzi Esquinca, M. E., Castro, L. M. d. Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies. J. Vis. Exp. (177), e62971, doi:10.3791/62971 (2021).

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