Preparazione del campione e quantificazione relativa mediante metilazione riduttiva delle ammine per studi peptidomici

Le scienze “omiche” sono caratterizzate dall’analisi approfondita di un insieme di molecole, come DNA, RNA, proteine, peptidi, metaboliti, ecc. Questi set di dati generati su larga scala (genomica, trascrittomica, proteomica, peptidomica, metabolomica, ecc.) hanno rivoluzionato la biologia e portato a una comprensione avanzata dei processi ^biologici1. Il termine peptidomico cominciò ad essere introdotto all’inizio del 20 ^° secolo e alcuni autori si sono riferiti ad esso come una branca della proteomica2. Tuttavia, la peptidomica ha peculiarità distinte, dove l’interesse principale è quello di indagare il contenuto di peptidi generati naturalmente durante i processi cellulari, nonché la caratterizzazione dell’attività biologica di queste ^molecole3,4.

Inizialmente, gli studi sui peptidi bioattivi erano limitati ai neuropeptidi e ai peptidi ormonali attraverso la degradazione di Edman e il test radioimmunologico. Tuttavia, queste tecniche non consentono un’analisi globale, a seconda dell’isolamento di ciascun peptide in alte concentrazioni, del tempo per la generazione di anticorpi, oltre alla possibilità di cross-reattività5.

L’analisi peptidomica è stata resa possibile solo dopo diversi progressi nella spettrometria di massa accoppiata a cromatografia liquida (LC-MS) e nei progetti sul genoma che hanno fornito pool di dati completi per studi di proteomica/peptidomica6,7. Inoltre, è stato necessario stabilire uno specifico protocollo di estrazione peptidica per le peptidome perché i primi studi che hanno analizzato i neuropeptidi a livello globale in campioni di cervello hanno dimostrato che il rilevamento era influenzato dalla massiccia degradazione delle proteine, che si verificano principalmente in questo tessuto dopo 1 minuto post-mortem. La presenza di questi frammenti peptidici mascherava il segnale neuropeptide e non rappresentava il peptidome in vivo. Questo problema è stato risolto principalmente con l’applicazione dell’inattivazione a riscaldamento rapido delle proteasi mediante irradiazione a microonde, che ha ridotto drasticamente la presenza di questi frammenti di artefatti e ha permesso non solo l’identificazione di frammenti neuropeptidici ma ha rivelato la presenza di un insieme di peptidi da proteine citosoliche, mitocondriali e nucleari, diverse da degradome6,8,9.

Queste procedure metodologiche hanno permesso un’espansione del peptidome oltre i ben noti neuropeptidi, dove centinaia di peptidi intracellulari generati principalmente dall’azione dei proteasomi sono stati identificati nel ^lievito10, nel pesce ^zebra11, nei tessuti dei ^roditori12 e nelle cellule ^umane13. Dozzine di questi peptidi intracellulari hanno ampiamente dimostrato di avere attività sia biologiche che ^{farmacologiche14,15}. Inoltre, questi peptidi possono essere utilizzati come biomarcatori di malattia e possibilmente hanno un significato clinico, come dimostrato nel liquido cerebrospinale da pazienti con aneurismi sacculari ^{intracranici16}.

Attualmente, oltre all’identificazione di sequenze peptidiche, è possibile attraverso la spettrometria di massa ottenere dati di quantificazione assoluta e relativa. Nella quantificazione assoluta, i livelli peptidici in un campione biologico vengono confrontati con gli standard sintetici, mentre nella relativa quantificazione, i livelli peptidici vengono confrontati tra due o più ^campioni17. La quantificazione relativa può essere eseguita utilizzando i seguenti approcci: 1) “label free”¹⁸; 2) etichettatura metabolica in vivo o 3) etichettatura chimica. Gli ultimi due si basano sull’uso di forme isotopiche stabili incorporate nei peptidi19,20. Nell’analisi senza etichetta, i livelli di peptidi sono stimati considerando la potenza del segnale (conteggi spettrali) durante l’LC-MS18. Tuttavia, l’etichettatura isotopica può ottenere livelli relativi più accurati di peptidi.

Molti studi peptidomici hanno utilizzato reagenti di etichettatura del butirrato trimetilammonio (TMAB) come etichettatura chimica e, più recentemente, sono stati utilizzati la metilazione riduttiva delle ammine (RMA) con forme deuterate e non deuterate di reagenti di formaldeide e cianoboroidruro di sodio11,21,22. Tuttavia, le etichette TMAB non sono disponibili in commercio e il processo di sintesi è molto laborioso. D’altra parte, nell’RMA, i reagenti sono disponibili in commercio, poco costosi rispetto ad altre etichette, la procedura è semplice da eseguire e i peptidi etichettati sono ^stabili23,24.

L’uso di RMA comporta la formazione di una base di Schiff consentendo ai peptidi di reagire con la formaldeide, seguita da una reazione di riduzione attraverso la cianoboroidruro. Questa reazione provoca la dimetilazione di gruppi amminici liberi su N-terminali e catene laterali di lisina e monometilati Proline N-terminali. Come i residui di prolina sono spesso rari sul N-terminale, praticamente tutti i peptidi con ammine libere sul N-terminus sono etichettati con due gruppi metilici23,24,25^.