Préparation des échantillons et quantification relative à l’aide de la méthylation réductrice des amines pour les études peptidomiques

Les sciences « omiques » sont caractérisées par l’analyse approfondie d’un ensemble de molécules, telles que l’ADN, l’ARN, les protéines, les peptides, les métabolites, etc. Ces ensembles de données générés à grande échelle (génomique, transcriptomique, protéomique, peptidomique, métabolomique, etc.) ont révolutionné la biologie et conduit à une compréhension avancée des processus ^biologiques1. Le terme peptidomique a commencé à être introduit au début du ^20ème siècle, et certains auteurs l’ont appelé une branche de la protéomique2. Cependant, la peptidomique présente des particularités distinctes, où l’intérêt principal est d’étudier la teneur en peptides générés naturellement au cours des processus cellulaires, ainsi que la caractérisation de l’activité biologique de ces ^{molécules3,4}.

Initialement, les études sur les peptides bioactifs étaient limitées aux neuropeptides et aux peptides hormonaux par dégradation d’Edman et dosage radioimmunologique. Cependant, ces techniques ne permettent pas une analyse globale, en fonction de l’isolement de chaque peptide à des concentrations élevées, du temps de génération d’anticorps, en dehors de la possibilité de réactivité ^croisée5.

L’analyse peptidomique n’a été rendue possible qu’après plusieurs avancées dans la spectrométrie de masse couplée par chromatographie liquide (LC-MS) et des projets de génome qui ont fourni des pools de données complets pour les études protéomiques / peptidomics6,7. De plus, un protocole d’extraction peptidique spécifique pour les peptidomes devait être établi car les premières études qui ont analysé les neuropeptides à l’échelle mondiale dans des échantillons de cerveau ont montré que la détection était affectée par la dégradation massive des protéines, qui se produisent principalement dans ce tissu après 1 min post-mortem. La présence de ces fragments peptidiques masquait le signal neuropeptide et ne représentait pas le peptidome in vivo. Ce problème a été résolu principalement avec l’application de l’inactivation rapide par chauffage des protéases à l’aide de l’irradiation par micro-ondes, ce qui a considérablement réduit la présence de ces fragments d’artefacts et a permis non seulement l’identification de fragments de neuropeptides, mais a révélé la présence d’un ensemble de peptides de protéines cytosoliques, mitochondriales et nucléaires, différentes de degradome6,8,9.

Ces procédures méthodologiques ont permis une expansion du peptidome au-delà des neuropeptides bien connus, où des centaines de peptides intracellulaires générés principalement par l’action des protéasomes ont été identifiés dans la ^levure10, le poisson-zèbre11, les tissus de ^rongeurs12 et les cellules ^humaines13. Il a été largement démontré que des dizaines de ces peptides intracellulaires ont des activités biologiques et ^{pharmacologiques14,15}. En outre, ces peptides peuvent être utilisés comme biomarqueurs de la maladie et éventuellement avoir une signification clinique, comme démontré dans le liquide céphalo-rachidien chez les patients atteints d’anévrismes sacculaires intracrâniens16.

Actuellement, en plus de l’identification des séquences peptidiques, il est possible par spectrométrie de masse d’obtenir des données de quantification absolue et relative. Dans la quantification absolue, les niveaux de peptides dans un échantillon biologique sont comparés à des étalons synthétiques, tandis que dans la quantification relative, les niveaux de peptides sont comparés entre deux échantillons ou ^plus17. La quantification relative peut être effectuée à l’aide des approches suivantes : 1) « sans étiquette »¹⁸; 2) marquage métabolique in vivo ou 3) marquage chimique. Les deux derniers sont basés sur l’utilisation de formes isotopiques stables incorporées dans des ^{peptides19,20}. Dans l’analyse sans étiquette, les niveaux de peptides sont estimés en tenant compte de l’intensité du signal (comptage spectral) pendant le LC-MS18. Cependant, le marquage isotopique peut obtenir des niveaux relatifs plus précis de peptides.

De nombreuses études peptidomiques ont utilisé des réactifs de marquage du butyrate de triméthylammonium (TMAB) comme marquage chimique et, plus récemment, la méthylation réductrice des amines (RMA) avec des formes deutérées et non deutérées de formaldéhyde et de réactifs cyanoborohydrure de sodium ont été utilisées11,21,22. Cependant, les étiquettes TMAB ne sont pas disponibles dans le commerce et le processus de synthèse est très laborieux. D’autre part, dans le RMA, les réactifs sont disponibles dans le commerce, peu coûteux par rapport aux autres étiquettes, la procédure est simple à effectuer et les peptides marqués sont ^stables23,24.

L’utilisation de RMA consiste à former une base de Schiff en permettant aux peptides de réagir avec le formaldéhyde, suivie d’une réaction de réduction à travers le cyanoborohydrure. Cette réaction provoque la diméthylation des groupes aminés libres sur les chaînes latérales N-terminales et lysine et les monométhylates N-terminaux prolines. Comme les résidus de proline sont souvent rares sur le N-terminal, pratiquement tous les peptides avec des amines libres sur le N-terminus sont marqués avec deux groupes méthyle23,24,25^.