使用胺还原甲基化进行样品制备和相对定量，用于肽学研究

“组学”科学的特点是对分子集进行深入分析，例如DNA，RNA，蛋白质，肽，代谢物等。这些生成的大规模数据集（基因组学、转录组学、蛋白质组学、肽学、代谢组学等）彻底改变了生物学，并导致了对生物过程的高级理解¹。肽学一词在20^世纪初 开始引入，一些作者将其称为蛋白质组学的一个分支²。然而，肽学具有独特的特殊性，其主要兴趣是研究细胞过程中自然产生的肽含量，以及这些分子的生物活性的表征^3，4。

最初，生物活性肽研究仅限于通过Edman降解和放射免疫测定的神经肽和激素肽。然而，这些技术不允许进行全局分析，这取决于高浓度中每种肽的分离，抗体产生的时间，以及交叉反应性的可能性⁵。

只有在液相色谱耦合质谱（LC-MS）和基因组项目取得多项进展后，肽学分析才成为可能，这些项目为蛋白质组学/肽学研究提供了全面的数据池^6，7。此外，需要建立针对肽酶的特定肽提取方案，因为第一批分析大脑样本中全球神经肽的研究表明，检测受到蛋白质大规模降解的影响，蛋白质在死后1分钟后主要发生在该组织中。这些肽片段的存在掩盖了神经肽信号，并不代表 体内的肽组。这个问题主要通过使用微波照射对蛋白酶进行快速加热灭活来解决，这大大减少了这些伪影片段的存在，不仅允许鉴定神经肽片段，而且揭示了来自胞质，线粒体和核蛋白的一组肽的存在，与降解^6，8，9不同。

这些方法论程序允许肽组扩展到众所周知的神经肽之外，其中主要由蛋白酶体作用产生的数百种细胞内肽已在酵母¹⁰，斑马鱼^11，啮齿动物组织¹²和人类细胞^{中鉴定出来13}。数十种这些细胞内肽已被广泛证明具有生物学和药理活性^14，15。此外，这些肽可用作疾病生物标志物，并可能具有临床意义，如颅内囊性动脉瘤患者的脑脊液¹⁶所示。

目前，除了肽序列的鉴定外，还可以通过质谱法获得绝对和相对定量的数据。在绝对定量中，将生物样品中的肽水平与合成标准品进行比较，而在相对定量中，比较两个或多个样品中的肽水平¹⁷。可以使用以下方法进行相对定量：1）”无标签”¹⁸;2） 体内 代谢标记或3）化学标记。最后两个是基于使用掺入肽中的稳定同位素形式^19，20。在无标记分析中，通过考虑^LC-MS18期间的信号强度（光谱计数）来估计肽水平。然而，同位素标记可以获得更准确的肽相对水平。

许多肽研究使用丁酸三甲基铵（TMAB）标记试剂作为化学标记，最近，胺的还原甲基化（RMA）与氘化和非氘代形式的甲醛和氰基硼氢化钠试剂已被使用^11，21，22。然而，TMAB标签不是市售的，合成过程非常费力。另一方面，在RMA中，试剂是市售的，与其他标记相比便宜，程序易于执行，并且标记的肽稳定^23，24。

RMA的使用涉及通过允许肽与甲醛反应来形成希夫碱，然后通过氰基硼氢化物进行还原反应。该反应引起N端和赖氨酸侧链和单甲基化N端脯氨酸上的游离氨基的二甲基化。脯氨酸残基在N端通常很少见，几乎所有在N端具有游离胺的肽都标有两个甲基^{23，24，25。}