DUCT: Çift Reçine Dökümü ve ardından 3D Karaciğer Analizi için Mikro Bilgisayarlı Tomografi

Bu çalışmada açıklanan protokol onaylanmıştır ve Stockholms Norra Djurförsöksetiska nämnd’ın (Stockholm hayvan araştırma etik kurulu) hayvan refahı kural ve yönetmeliklerine uyar. Bu çalışmada kullanılan hayvanlar, karışık C3H / N ve C57bl6J arka plan üzerinde vahşi tip veya homozigous Jag1H268Q mutant farelerdi. Çalışmaya hem erkekler hem de kadınlar dahil edildi. Hayvanlar doğum sonrası 15 günde veya 3 – 8 ay arasında yetişkin olarak kullanıldı. 1. Çift reçine enjeksiyonları HazırlıkReçine çözeltisi hazırlayın. Çift sistemli reçine enjeksiyonları için, 1.1.2-1.1.4 adımlarında açıklandığı gibi hem sarı hem de yeşil reçineler hazırlayın. Fare başına 1 mL seyreltilmiş reçine aliquots hazırlayın. Sarı Reçine: Sarı reçineyi enjeksiyona hazırlamak için sarı silikon kauçuğunu (yüksek radyopaklık) 3:1 seyreltmede açık seyreltici ile seyreltin. Yeşil Reçine: Mavi reçine hazırlamak için mavi silikon kauçuk (tespit edilemeyen radyopaklık) ile 1:1 seyreltmede açık seyreltici ile karıştırın. Yeşil reçine üretmek için seyreltilmiş mavi reçineyi seyreltilmiş sarı reçine ile 1:1 oranında karıştırın. Renk homojen olana kadar yeşil reçineyi iyice girdapla.NOT: Mavi reçine, mikroCT ile tespit edilemeyen çok düşük radyopaklığa sahiptir, bu nedenle farklı radyopaklıklara sahip iki reçine oluşturmak için sarı reçine ile seyreltilmesini gerektirir.DİkKAT: Reçine, kanserojen olan kurşun kromat içerebilir. Yangında zehirli gazlar üretir. Reçineyi dikkatli bir şekilde işleyin ve tehlikeli atık olarak atın. 1.1.6-1.1.11 adımlarında açıklandığı gibi iki enjeksiyon seti (enjeksiyon seti #1 ve enjeksiyon seti #2) boru ile hazırlayın.NOT: Yetişkin fareler için (>P30 (doğum sonrası gün 30) = P30 – 2 yıl), portal damar enjeksiyonu için ortak safra kanalı enjeksiyonu ve enjeksiyon seti #2 (0,96 mm dış çapa sahip PE50 boru) için enjeksiyon seti #1 (0,6 mm dış çaplı PE10 boru) kullanın. Genç doğum sonrası fareler için (P30’a kadar), biri safra kanalı ve diğeri portal damar enjeksiyonu için olmak üzere iki #1 enjeksiyon seti hazırlayın (portal damarı PE50 borularına uyum sağlamak için çok dar olduğu için enjeksiyon seti #2 yok). Enjeksiyon seti #1 hazırlamak için, 30 cm PE10 boruyu kesin ve borunun bir ucunu mümkün olduğunca ince hale gelinceye kadar çekerek elle uzatın (Şekil 1A, B, yaklaşık 0,15 mm çapında, gerilmemiş PE10 boru 0,6 mm çapındadır). Eğimli bir uç oluşturmak için gerilmiş PE10 borunun ucunu çapraz olarak kesin (Şekil 1B). PE10 borunun gerilmemiş ucunu 30 G iğneye bağlayın (Şekil 1A, Enjeksiyon seti #1). Enjeksiyon seti #2 hazırlamak için, 30 cm PE50 boruyu kesin ve borunun bir ucunu portal damarına sığacak kadar ince hale gelene kadar çekerek elle uzatın (Şekil 1A, B, yaklaşık 0,7 mm, gerilmemiş PE50 boru 0,96 mm çapındadır). Eğimli bir uç oluşturmak için gerilmiş PE50 borunun ucunu çapraz olarak kesin (Şekil 1B). PE50 borunun gerilmemiş ucunu 23 G iğneye bağlayın (Şekil 1A, enjeksiyon seti #2).NOT: Reçine şırınna ve boruda sertleşeceğinden, her enjeksiyon seti sadece bir enjeksiyon için kullanılabilir. Gerilmiş ve eğimli ucun boyutunu, yaşına, genotipine ve fenotipine bağlı olarak farenin ortak safra kanalının ve portal damarının boyutuna göre ayarlayın. Borunun boyutundan ve uygun halinden emin değilken, boruyu kesiden sonra ve boru reçine ile doldurulmadan önce uygun kanala veya tekneye yerleştirin. Boru kanala/tekneye sığmayacak kadar genişse, daha da uzatın. Hayvanı izofluran inhalasyonu ile uyuşturun (indüksiyon odasında ilk% 4 ve burun konisini kullanarak ~ % 2). Fare burun konisine izofluran solurken fareyi havalandırmalı bir bankın üzerine bir diseksiyon pedi üzerine yerleştirin. Hayvanın, örneğin pençelerden birini kıstırarak enstitü / IRB tarafından önerilen bir yöntemle bilinçsiz olduğunu doğrulayın.DİkKAT: İzofluran solunduğunda uyuşukluğa veya baş dönmesine neden olabilir ve uzun süreli veya tekrarlanan maruziyet yoluyla kardiyovasküler sisteme ve merkezi sinir sistemine zarar verebilir. Onu içine çekme. Maddeyi havalandırılmış bir bankta ve iyi havalandırılmış alanlarda ele alın.NOT: Kardiyak perfüzyon ile uyumlu olduğu sürece başka bir anestezi yöntemi kullanmak mümkündür. Hayvan bilinçsiz olduğunda, kürkün karışmasını önlemek için ventral tarafına% 70 etanol püskürtün. Cilt makası kullanarak, karın boşluğunun orta hattından başlayarak cildi, fasyayı ve kas tabakasını kesin ve iç organları açığa çıkarmak için torasik boşluğa kesin. Sternumu kaldırmak için 11oid işlemini tokmaklarla tutun ve kalbi ve akciğerleri açığa çıkarmak için her iki taraftaki diyaframı ve göğüs kafesini kesin. Göğüs kafesinin sol ve sağ tarafındaki kaburgaları makasla keserek göğüs kafesini çıkarın. Reçinenin sızmasına neden olacağından karaciğere zarar vermemeye ekstra özen gösterecektir. Düz tokparlamalar kullanarak kalbi karaciğere doğru çekin ve sağ kulakçık kesin. Peristaltik perfüzyon pompasına bağlı bir kelebek iğnesini (23 G) sol ventriküle yerleştirin. Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ve heparin (1 U/g fare vücut ağırlığı) ile fareyi transkardiyöz olarak kullanın. 5 mL / dk perfüzyon oranı ile 3 dakika perfuse.NOT: Fare doğru şekilde perfüzyona maruz kalırsa, iç organlar, özellikle karaciğer soluklaşır. Bunun yerine, akciğerler beyaza dönüyorsa, iğne sağ ventriküle yerleştirilir ve yeniden konumlandırılmalıdır. Perfüzyondan sonra, fare çıkarılır ve burun konisi ve izoflurandan çıkarılabilir. Izofluran pompasını kapatın. Reçine enjeksiyonu – Safra sistemi reçine dökümüFareyi diseksiyon mikroskobuna, karnı yukarı, deneyciye doğru kuyruk ve deneyciden uzağa gidin. İlgi çekici anatomik simgesel yapılar Şekil 2A’da tasvir edilmektedir. Bağırsağı yana doğru hareket ettirerek alt vena kavasını (Şekil 2A) bulun. Hepatik damar basıncının salınmasını sağlamak için alt vena kavasında küçük bir transversal kesi yapmak için yay makası kullanın (Şekil 2Bi). 1.2.4- 1.2.6 adımlarında açıklandığı gibi ortak safra kanalını ve portal damarı ortaya çıkarın. Fosfat tamponlu salin (PBS) ıslatılmış pamuklu çubuk kullanarak bağırsak ve pankreası sağ tarafa (deneycinin) hareket ettirin. Viseral yüzeyi ve hilar bölgeyi açığa çıkarmak için PBS ıslatılmış pamuklu çubuğu kullanarak karaciğerin ventral tarafını kalbe doğru çevirin. Hilar bölgesinden pankreas boyunca ve Oddi sfinkter’inde bağırsağa uzanan ortak safra kanalını bulun (Şekil 2Bii, sarı noktalı çizgi ile özetlenen ortak safra kanalı, siyah ok uçları Oddi’nin Sfinkter’ini gösterir).NOT: Karaciğeri PBS ile serperek işlem boyunca nemli olduğundan emin olun. Düz kümesler kullanarak ortak safra kanalından çevre dokuyu (alan ~ 5 mm) temizleyin. İpek dikiş ipliğini (boyut 4-0, 0,17 mm, 3 – 5 cm uzunluğunda) ortak safra kanalının altına yerleştirin (Şekil 2Bii) ve ortak safra kanalının etrafına gevşek bir el üstü düğüm bağlayın (Şekil 2Biii).NOT: Oddi’nin hilar bölgesi ile sfinkteri arasındaki düğüm için bir alan seçin ve portal damardan bir mesafede, böylece dikiş ortak safra kanalının etrafına sıkıldıktan sonra portal damar enjeksiyonuna müdahale etmeyecektir. Ortak safra kanalının Oddi sfinkterinin yanındaki pankreas ve bağırsağa girdiği noktada ortak safra kanalına eğik bir kesi yapmak için yay makasını ortak safra kanalına karşı düz tutun. (Şekil 2Biv), sarı noktalı çizgi, siyah ok uçlarıyla vurgulanan Oddi bölgesinin sfinkterini özetler.NOT: Bu çok önemli bir adımdır. Bir eğiklik yapın, bir transversal kesim yapmayın ve bir kesi yapın; safra kanalını kesmeyin. Tüm safra kanalını kesmek, borunun takılmasını çok zorlaştırır. Kullanmadan hemen önce, sarı reçinenin 1 mL’lik kısmını kürleme maddesinin 50 μL’si ile karıştırın (1 mL şırınnayı doldurup boşaltarak) ve 1 mL Luer şırınnasını reçine – kürleyici madde karışımı ile doldurun. Dolu şırınnayı boruya bağlayın (ayar no 1). Boruyu tamamen doldurmak için pistona basın. Reçine/kürleme maddesinin borunun ucundan damlamasını sağlayın.NOT: En iyi sonuçları elde etmek için şırınna ve borudaki kabarcıklardan kaçının ve çıkarın. Uzun uçları kullanarak, ortak safra kanalı kesisinin etrafındaki alanı düzeltin ve boruyu ortak safra kanalındaki açıklığa yerleştirin (Şekil 2Bv), eğimli ucun en uzun kenarı safra kanalının dorsal tarafına doğru aşağı doğru. Bu yönlendirme, reçinenin yukarı bakan boru açıklığını kanala çıkarabilmesini sağlar (Şekil 2Bv). Boruyu ortak safra kanalının içine sabitlemek için ipek iplik düğümünü sıkın (Şekil 2Bvi). Reçineyi ortak safra kanalına enjekte edin. Safra kesesini ve bireysel karaciğer loblarını gözlemleyin. Reçinenin eşit şekilde yayılmasına yardımcı olmak için karaciğere PBS ıslatılmış pamuklu çubukla masaj yapın. Reçine dolu safra kanallarının terminal dalları (vahşi tip farelerde) karaciğer yüzeyinde hafifçe görülebilir.NOT: Karaciğeri doldurmak için beklenen süre 30 -100 s’dir. Karaciğerin yüzeyinde reçine noktaları göründüğünde (Şekil 2Ci, mavi ok uçları) veya direnç karşılandığında reçineyi enjekte etmeyi bırakın.NOT: Reçine kürleme maddesini ekledikten sonra reçine sertleşmeye başladığından beri mümkün olduğunca hızlı çalışın. Kürleme maddesini eklemekten çalışma süresi yaklaşık 15 dakikadır. Boruyu ortak safra kanalından çekerek çıkarın ve reçinenin dışarı sızmasını önlemek için tokalar kullanarak ipek düğümünü hızla sıkın. İpek dikişin gevşek uçlarını kesin, böylece portal damar enjeksiyonuna müdahale etmezler. Reçine içeren boruyu ve kalan reçineyi tehlikeli atıklara, iğneyi de keskin atıklara atın. Reçine enjeksiyonu – Portal ven reçine dökümü Portal damarı (alan ~5 mm) düz tokmaklar kullanarak karaciğere girişinden yaklaşık 2 cm uzaklıktaki çevresindeki dokusundan temizleyin. İpek dikiş ipliğini (boyut 4-0, 0,17 mm, 3 – 5 cm uzunluğunda) portal damarın temizlenmiş alanının altına yerleştirin (Şekil 2Ci) ve gevşek bir el üstü düğüm bağlayın (Şekil 2Cii). Portal damarda karaciğere ve düğüme karşı uzunlamasına bir kesi yapın (Şekil 2Ciii). Yeşil reçinenin 1 mL’lik kısmını kürleme maddesinin 50 μL’si ile karıştırın (1 mL şırınna doldurup boşaltarak) ve 1 mL Luer şırındını reçine kürleyici madde karışımı ile doldurun. Dolu şırınnayı boruya bağlayın (>P30 fareler için 2 numaralı set, <P30 fareler için yeni set #1). Boruyu tamamen doldurmak için pistona basın. Reçinenin borunun ucundan damlatılmasını sağlayın.NOT: En iyi sonuçları elde etmek için şırınna ve borudaki kabarcıklardan kaçının ve çıkarın. Tostikleri kullanarak, çevredeki dokuyu deneyciye doğru çekerek portal damarı düzleştirin ve eğimli ucun en uzun kenarına sahip boruyu damarın dorsal tarafına doğru yerleştirin (Şekil 2Ciii). Portal damardaki boruyu sabitlemek için ipek ipliği sıkın. Reçineyi portal damara enjekte et. Reçine ile dolu kan damarlarını gözlemleyin. Reçinenin eşit şekilde yayılmasına yardımcı olmak için karaciğere PBS ıslatılmış pamuklu çubukla masaj yapın (Şekil 2Civ). Tüm kan damarları dolduğunda (portal damarların uçları karaciğer çevresinde görülebilir) veya direnç karşılandığında reçineyi enjekte etmeyi bırakın.NOT: Kürleme maddesinin eklenmesinden sonra reçine sertleşmeye başladığından hızlı çalışın. Kürleme maddesini eklemeden elde edilen çalışma süresi, enjeksiyon kümesi #1 için yaklaşık 15 dakika ve enjeksiyon kümesi #2 için 25 dakikadır. Boruyu portal damardan çekerek çıkarın ve reçinenin dışarı sızmasını önlemek için ipek düğümünü hızlı bir şekilde sertlaştırın. Reçine içeren boruyu ve kalan reçineyi tehlikeli atıklara, iğneyi de keskin atıklara atın. Karaciğer diseksiyonu ve fiksasyonuTüm karaciğeri çevre dokudan ve diyaframdan keserek parçalara ayrıştırın. Karaciğerin deformasyonunu önlemek için tüm karaciğeri ventral tarafı yukarı bakacak şekilde ve sırt tarafı konik tüpün duvarına yaslı boş bir 50 mL konik tüpe hafifçe yerleştirin. Reçinenin tamamen sertleşmesi için konik tüpü yatay olarak 4 °C’de gece boyunca saklayın.NOT: Karaciğere sığacak kadar büyük olan herhangi bir kap 50 mL konik tüp yerine kullanılabilir. Düz bir alt kap kullanmak karaciğerin deforme olmama olasılığını artıracaktır. Karaciğeri tek tek loblara ayırın. MikroCT analizi (1.4.4-1.4.5) veya kalite kontrol (1.4.6-1.4.8) için kullanılacak loblardan bir seçim yapın. İsteğe bağlı olarak, tüm karaciğeri tek tek loblara ayırmadan hem optik temizleme hem de mikroCT için kullanın.NOT: Safra ve damar sistemlerinin karaciğer mimarisi her lobda farklıdır ve bu nedenle eşleştirilen lob analizleri gereklidir. Optik temizleme mikroCT taramasını engellemez ve kalite kontrolü için kullanılan loblar daha sonra mikroCT ile taranabilir. Buna karşılık, mikroCT ile taranan numuneler daha sonra karşılaştırma için optik olarak temizlenebilir. Böylece tüm karaciğer analizi mümkündür. Vahşi tip farelerde (C3H/C57bl6 genetik arka plan), sağ medial lob önce reçine enjeksiyonları ile doldurulur ve bu da bunu mikroCT analizi için uygun bir lob haline getirir ve en yüksek tekrarlanabilirlik ile. Sol lateral lob, enjeksiyon kalitesi için ön taramanın basit olduğu en büyük lobdur. Kalite kontrol ve mikroKT taraması için kullanılan lobun (veya tüm karaciğerin) seçimi hayvan modeli ve araştırma sorusuna bağlıdır. Havalandırılmış bir davlumbazda% 4 formaldehit çözeltisi hazırlayın (tüp başına 10 -20 mL). MikroCT için kullanılan lobları 4 °C’de bir gecede %4 formaldehit ile sabitlayın ve daha sonra PBS ile bir kez yıkayın (tüp başına 10 -20 mL). Formaldehit atıklarını ayrı bir kapta toplayın. Karaciğer loblarını kısa süreli depolama için PBS’de 4 °C’de veya uzun süreli depolama için% 70 etanolde tutun. Bölüm 2: Mikro bilgisayarlı tomografi ile devam edin.DİkKAT: Formaldehit yutulursa, solunursa veya ciltle temas halinde akut toksisiteye neden olur. Formaldehit yanıcı bir sıvı ve buhardır. Ciddi cilt yanıklara ve göz hasarına neden olur. Alerjik cilt reaksiyonuna neden olabilir. Solunduğunda ölümcüldür (konsantre veya toz halinde). Solunum tahrişi neden olabilir. Genetik bozukluklara yol açtığından şüphelenilmiş. Kansere neden olabilir. Organlarda hasara neden olur (gözler, merkezi sinir sistemi). Önlem ifadeleri – ısıdan, sıcak yüzeylerden, kıvılcımlardan, açık alevlerden ve diğer ateşleme kaynaklarından uzak tutun. Sigara içilmez. Koruyucu eldiven ve koruyucu giysiler giyin. Dökülme durumunda, kirlenmiş tüm kıyafetleri derhal çıkarın. Ciltle temas halindeyseniz: kirlenmiş bölgeyi suyla durulayın. Solunursa: kişiyi temiz havaya çıkarın ve rahatsa nefes almayı izleyin. Hemen bir zehir merkezi / doktor arayın. Gözlerde ise: gözleri birkaç dakika suyla durulayın. Varsa ve mümkünse kontakt lensleri çıkarın. Kalite kontrolü için, kalan lobları (en az bir) % 50 metanol (deiyonize su ile karıştırılır) ile en az 4 saat boyunca sabitlayın, oda sıcaklığında sallanır, ardından oda sıcaklığında bir gecede sallanan% 100 metanol. Metanol atıklarını ayrı bir kapta toplayın.DİkKAT: Metanol yutulursa, solunursa veya ciltle temas halinde akut toksisiteye neden olur. Metanol yanıcı bir sıvı ve buhardır. Koruyucu eldiven ve kıyafet giyin. Yol tutuşu yaparken nefes almaktan kaçının ve ateş ve ısıdan uzak durun. Kullandıktan sonra cildi iyice yıkayın. Dökülme durumunda, tüm kontamine giysileri derhal çıkarın. Cildi suyla durulayın. Solunursa: Kişiyi temiz havaya çıkarın ve nefes almak için rahat tutun. Solunduğunda, yutulmasında veya maruz kalınması durumunda bir zehir merkezi/ doktor çağırır. Havalandırılmış bir kaputta benzil alkol ve benzil benzoat (BA: BB, 1:2) (lob başına 5 -10 mL) çözeltisi hazırlayın. Karaciğer lobunu BABB çözeltisi içeren 15 veya 50 mL’lik bir polipropilen tüpe (lobun büyüklüğüne bağlı olarak) yerleştirin. Şeffaf olana kadar oda sıcaklığında sallayın. Bu adım lobun büyüklüğüne bağlı olarak 2-16 saat arasında sürebilir.NOT: BABB çözeltisi belirli plastik türlerini çözrür. Numuneleri polipropilen tüplerde veya cam kaplarda saklamak güvenlidir.DİkKAT: Benzil benzoat yutuldığında akut toksisiteye neden olabilir. Uzun süreli etkileri olan sucul yaşam için toksiktir. Önlem ifadeleri: Kullanımdan sonra cildi iyice yıkayın. Yutulduğunda, ciltle temas ettiğinde veya solunduğunda zararlıdır. Duman/buhar solumaktan kaçının. Elleçlemeden sonra ellerinizi iyice yıkayın. Bu ürünü kullanırken yemeyin, içmeyin veya sigara içmeyin. Yutulursa – iyi değilse bir zehir merkezi / doktor çağıryın Havalandırılan alanlarda kullanın. Dökülmeyi toplayın. İçeriği/konteyneri onaylanmış bir atık bertaraf tesisine atın. Enjeksiyonun kalitesini inceleyin. Sadece iyi enjekte edilmiş karaciğer mikroCT ile taranmalıdır. 2. Mikro bilgisayarlı tomografi Numune hazırlama 100 mL damıtılmış su ve 1 g agarose toz karıştırarak% 1 agarose jeli hazırlayın. Karışımı bir mikrodalga fırına yerleştirin ve agarose tozu çözünene kadar çözeltiyi kaynatın. Karaciğer örneğinin termal hasar görmesini önlemek için% 1 agarose jelini ~ 40 ° C’ye temperleyin. İlgi çekici lobları 15 mL konik bir tüpe yerleştirin ve tüpün toplam hacminin yaklaşık 2/3’üne% 1 agarose jel ile doldurun. Bu adım, CT ölçümü sırasında istenmeyen numune hareketini en aza indirir. CT ölçümüNOT: Aşağıdaki adımlar CT cihazına bağlıdır ve farklı CT aygıtları ve üreticileri için belirli ayarlar ve eylemler farklılık gösterebilir. Bu protokolde, kullanılan mikro bilgisayarlı tomografi tarayıcısı, CT ölçümleri için nanofocus X-ray tüpü (180 kV/15 W) ve düz panel dinamiği 41|100 (4048 piksel x 4048 piksel, binning 2 ile piksel boyutu 100 mm) ile donatılmıştır. 15 mL konik tüpü bir CT cihazının dönme aşamasına örnekle monte edin ve ölçüm odasına en az 1 saat boyunca termal olarak adapte olmasını sağlayın. Örnek termal olarak uyarlandığında, Görüş Alanı’nda (FOV) ortala. Kaynak numune ve numune dedektörü mesafelerini optimize edin (SSD, SDD) yeterli voksel çözünürlüğe ulaşmak için, örneğin, yetişkin bir murine karaciğer örneği için 12 μm veya <P30 karaciğeri için 6,5 μm, FOV boyutlarına karşılık gelen (önceden belirtilen donanım için) 24,3 mm × 24,3 mm ve 13,2 mm × 13,2 mm. Ct cihazı üreticisinin tespit edilen yeterli sinyal seviyesine ulaşmak için tavsiyelerini izleyerek alım parametrelerini (örneğin, voltaj ve akımın hızlandırılması, pozlama, binning, ortalama) ayarlayın. Bu parametreler sadece CT cihazına bağımlı değil, aynı zamanda örneğe de bağımlıdır ve her örnek için en iyi duruma getirilmelidir. Hankeova ve ark.9’da ayarlar şöyleydi: 80 kV hızlanan voltaj, 160 μA hızlanan akım, 400 ms pozlama süresi ve 2000 görüntü. Tomografiye başlayın. CT verilerini yeniden oluşturmak için özel bir tomografik rekonstrüksiyon yazılımı kullanın. 3. Analiz ve veri segmentasyonu NOT: Aşağıdaki adımlar görüntü işleme yazılımına bağlıdır; belirli ayarlar ve eylemler kullanılan yazılıma bağlı olarak farklılık gösterebilir. CT verilerini yükleme: Dosya > > Al Komutunu seçin. Başka bir seçim, işlenecek CT verilerinin belirli biçimine bağlıdır. Genel eşik kullanarak verilerdeki reçineyi segmentlere ayırmak için üst paneldeki Yüzey Belirleme işlevini kullanın. İletişim penceresinde, kırmızı “Isovalue” çizgisinin konumunu yalnızca reçine dolu damarları (örneğin, sunulan “Önizleme panelinde” sarı çizgiyle kapsanan) segmentlere ayırarak histogram değerlendirmesiyle eşik değerini belirleyin (Şekil 3A). Sol panelde, reçine dolu gemilerin ilgi çekici bir bölgesini (ROI) oluşturmak için Hacim/CAD/Mesh’ten yatırım getirisi oluştur modülini seçin. İletişim penceresinde, Katı’dan yatırım getirisi oluştur seçeneğini kullanın, işlenen birimin adını seçin ve onaylayın. Bu yatırım getirisinin arka plan bölgesindeki gürültü kümelerinin hatalı segmentasyonunu ortadan kaldırın. Bu yatırım getirisini sağ panelde işaretleyin, üzerine sağ tıklayın ve Yatırım Getirisini Böl modülini seçin. İletişim penceresinde, Tüm gürültü parçacıklarını dışlamak için Minimum Ses Düzeyi [voxel] parametresini ayarlayın – bu değer deneme ve veriye bağımlıdır ve analiz edilecek her örnek için en iyi duruma getirilmelidir (Şekil 3B). Reçine döküm yatırım getirisinde eser olmadan pürüzsüz, sürekli ve katı kanal maskeleri oluşturun – örneğin, hava kabarcıklarının varlığı veya reçine sızıntısı. Sol panelde Yumuşatma modülunu kullanın, Yumuşatma Mukavemeti parametresini 1 veya 2 olarak ayarlayın (tek tek verilere bağlı olarak, daha yüksek değerlerin özellikle ince yapılarla uğraşırken model deformasyonuna yol açabileceği zaman). Gerekirse, bu işlemi iki kez çalıştırın (Şekil 3C). Parçalı reçine maskesinde tek tek borulu sistemleri tanımlayın ve ayırın. CT verilerinde daha yüksek yoğunluklu değerlere sahip daha absorptif reçine (ortak safra kanalı enjeksiyonu için kullanılan sarı reçine) ile dolu sistem için ayrı bir yatırım getirisi oluşturun. 3.2. adımda açıklanan yordamı izleyin. (Şekil 3Di). Yeni yatırım getirisini ve reçine maskesi yatırım getirisini işaretleyin, sağ tıklatın ve Yatırım Getirilerini Çıkar’ı seçin ve kalan tübüler sistem için yeni bir yatırım getirisi oluşturmak üzere yeni yatırım getirisini reçine maskesi yatırım getirisinden çıkarın (Şekil 3Dii, iii). Farklı yazılımlarda daha sonra işlem için operatör tercihlerine göre her iki borulu sistem için de elde eden ROI’leri çeşitli biçimlerde dışa aktarın. Ayrıca, elde eden ROI’leri bir birim grafik yazılımında işleyerek son görselleştirmeyi bir görüntü veya video biçiminde dışa aktarabilirsiniz.