DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis

Simona Hankeova; Jakub Salplachta; Noemi Van Hul; Michaela Kavkova; Afshan Iqbal; Tomas Zikmund; Jozef Kaiser; Emma R. Andersson

doi:10.3791/62941

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Tıp

DUCT: Double coulée de résine suivie d’une micro-tomodensitométrie pour l’analyse 3D du foie

Published: September 28, 2021

doi:

10.3791/62941

Simona Hankeova*¹, Jakub Salplachta*², Noemi Van Hul¹, Michaela Kavkova², Afshan Iqbal¹, Tomas Zikmund², Jozef Kaiser², Emma R. Andersson¹

¹Karolinska Institutet, ²Central European Institute of Technology

Özet

La micro-tomodensitométrie à double coulée de résine, ou DUCT, permet la visualisation, la numérisation et la segmentation de deux systèmes tubulaires simultanément pour faciliter l’analyse 3D de l’architecture des organes. DUCT combine l’injection ex vivo de deux résines radio-opaques suivie d’un balayage par micro-tomodensitométrie et d’une segmentation des données tomographiques.

Abstract

Le foie est le plus grand organe interne chez l’homme et la souris, et l’autofluorescence élevée présente un défi important pour évaluer l’architecture tridimensionnelle (3D) de l’organe au niveau de l’organe entier. L’architecture du foie est caractérisée par de multiples structures lumineuses ramifiées, qui peuvent être remplies de résine, y compris des arbres vasculaires et biliaires, établissant un modèle hautement stéréotypé dans le parenchyme autrement riche en hépatocytes. Ce protocole décrit le pipeline pour effectuer une micro-tomodensitométrie de coulée de résine double, ou « DUCT ». DUCT consiste à injecter la veine porte et le canal biliaire commun avec deux résines synthétiques radio-opaques différentes, suivies d’une fixation tissulaire. Le contrôle de la qualité en nettoyant un lobe, ou l’ensemble du foie, avec un agent de nettoyage optique, permet un pré-dépistage des échantillons correctement injectés. Dans la deuxième partie du pipeline DUCT, un lobe ou l’ensemble du foie peut être utilisé pour la micro-tomodensitométrie (microCT), la segmentation (semi-)automatisée et le rendu 3D des réseaux veineux et biliaires portals. MicroCT donne des données de coordonnées 3D pour les deux résines permettant une analyse qualitative et quantitative des deux systèmes et de leur relation spatiale. DUCT peut être appliqué au foie de souris postnatal et adulte et peut être étendu à d’autres réseaux tubulaires, par exemple, les réseaux vasculaires et les voies respiratoires dans les poumons.

Introduction

La coulée de résine d’orgue est une technique qui remonte au ^17ème ^siècle1. L’un des premiers exemples de moulage de résine moderne a été effectué sur le foie humain à partir d’une autopsie. Les voies biliaires intrahépatiques ont été remplies d’un agent de contraste mélangé à de la gélatine, suivies d’une imagerie par tomodensitométrie à rayons ^X2. L’objectif de la technique DUCT est de visualiser, numériser et analyser deux réseaux tubulaires moulés en résine, en tandem, en 3D.

DUCT est basé sur les connaissances approfondies existantes de la coulée de résine hépatique à système unique3,4,5,6,7,8 et s’étend à la visualisation et à l’analyse 3D simultanées de deux ^systèmes9. DUCT a avancé la coulée de résine simple à la coulée de résine double en mélangeant deux résines radio-opaques de contraste différent et en injectant ces résines dans deux réseaux différents, en particulier le canal biliaire commun et la veine porte. DUCT peut être appliqué à de jeunes souris postnatales avec des résultats reproductibles dès le jour postnatal 15 (P15). Par rapport aux techniques d’imagerie basées sur la microscopie, le principal avantage est que le DUCT est plus rapide, sans anticorps et que l’autofluorescence du tissu hépatique n’interfère pas avec l’imagerie. En outre, DUCT fournit des données quantitatives décrivant l’état de luminosité, le diamètre interne, la connectivité réseau et la perfusion. La différenciation entre la présence de cellules formant la lumière et leur morphogenèse de facto en tubes est essentielle pour analyser les organes dans lesquels des cellules ductulaires sont présentes mais ne forment pas de tubes, comme cela peut être le cas dans le syndrome d’Alagille10. Le principal inconvénient de DUCT est la pénétration limitée de la résine, qui est visqueuse et ne pénètre pas dans les tubes de petit calibre (<5 μm). DUCT peut être appliqué pour n’importe quelle structure tubulaire après avoir déterminé le point d’entrée d’injection, comme les systèmes circulatoire artériel et veineux, les voies respiratoires, le canal biliaire extrahépatique ou les vaisseaux lymphatiques. Il pourrait ainsi faciliter l’analyse de l’architecture d’organes entiers d’autres tissus tels que les poumons et le pancréas.

Les images segmentées MicroCT peuvent être traitées à l’aide de logiciels d’imagerie disponibles dans le commerce, tels qu’ImageJ, ou de pipelines écrits sur mesure (par exemple, MATLAB). Le foie injecté de résine peut être analysé qualitativement pour l’expansion et la connectivité du réseau ou quantitativement pour le volume, la longueur, la ramification, la tortuosité d’un seul système et l’interaction entre deux systèmes tels que la distance entre deux systèmes ou la dépendance au point de branchement (le système 1 se branche-t-il à proximité du système 2?). Le pipeline DUCT englobant l’injection de résine, le balayage microCT et la segmentation des données CT, combiné à une analyse quantitative détaillée des mécanismes architecturaux de deux systèmes tubulaires, pourrait fournir une norme pour l’analyse du foie entier dans des modèles animaux.

Protocol

Le protocole décrit dans cette étude a été approuvé et suit les règles et règlements en matière de bien-être animal du Stockholms Norra Djurförsöksetiska nämnd (comité d’éthique de la recherche animale de Stockholm). Les animaux utilisés dans cette étude étaient des souris mutantes Jag1H268Q de type sauvage ou homozygotes sur un fond mixte C3H/N et C57bl6J. Les hommes et les femmes ont été inclus dans l’étude. Les animaux ont été utilisés au 15e jour postnatal ou à l’âge adulte entre 3 et 8 mois. 1. Double injection de résine PréparationPréparer une solution de résine. Pour les injections de résine à double système, préparer les résines jaunes et vertes comme décrit aux étapes 1.1.2-1.1.4. Préparer 1 mL d’aliquotes de résine diluée par souris. Résine jaune: Diluer le caoutchouc de silicone jaune (radiopacité élevée) avec le diluant clair dans une dilution 3: 1 pour préparer la résine jaune pour l’injection. Résine verte: Mélanger le caoutchouc de silicone bleu (radiopacité indétectable) avec le diluant clair dans une dilution 1: 1 pour préparer la résine bleue. Pour générer de la résine verte, mélangez la résine bleue diluée avec la résine jaune diluée dans un rapport de 1:1. Vortex la résine verte à fond jusqu’à ce que la couleur soit homogène.REMARQUE: La résine bleue a une très faible radiopacité qui n’est pas détectable avec microCT, ce qui nécessite donc une dilution avec de la résine jaune pour créer deux résines avec des radiopacités différentes.ATTENTION : La résine peut contenir du chromate de plomb, qui est cancérigène. Il produit des gaz toxiques dans un incendie. Manipulez avec soin et éliminez la résine comme un déchet dangereux. Préparer deux ensembles d’injection (jeu d’injection n° 1 et jeu d’injection n° 2) avec des tubes comme décrit aux étapes 1.1.6 à 1.1.11.REMARQUE: Pour les souris adultes (>P30 (jour postnatal 30) = P30 – 2 ans), utilisez l’ensemble d’injection n ° 1 (tube PE10 avec un diamètre extérieur de 0,6 mm) pour l’injection de voies biliaires communes et l’ensemble d’injection n ° 2 (tube PE50 avec un diamètre externe de 0,96 mm) pour l’injection de veine porte. Pour les jeunes souris postnatales (jusqu’à P30), préparez deux ensembles d’injection n ° 1, un pour le canal biliaire et un pour l’injection de veine portale (pas d’ensemble d’injection n ° 2 car la veine porte est trop étroite pour accueillir un tube PE50). Pour préparer l’ensemble d’injection no 1, coupez 30 cm de tube pe10 et étirez une extrémité du tube à la main en le tirant jusqu’à ce qu’il devienne aussi mince que possible (Figure 1A, B, environ 0,15 mm de diamètre, tube PE10 non étiré de 0,6 mm de diamètre). Coupez l’extrémité du tube PE10 étiré en diagonale pour créer une pointe biseautée (Figure 1B). Connectez l’extrémité non étirée du tube PE10 à une aiguille de 30 G (Figure 1A, Jeu d’injection n° 1). Pour préparer l’ensemble d’injection no 2, coupez 30 cm de tube PE50 et étirez une extrémité du tube à la main en le tirant jusqu’à ce qu’il devienne suffisamment mince pour tenir dans la veine porte (Figure 1A, B, environ 0,7 mm, tube PE50 non étiré a un diamètre de 0,96 mm). Coupez la pointe du tube PE50 étiré en diagonale pour créer une pointe biseautée (Figure 1B). Connectez l’extrémité non étirée du tube PE50 à une aiguille de 23 G (Figure 1A, jeu d’injection n° 2).REMARQUE: Chaque ensemble d’injection ne peut être utilisé que pour une injection car la résine durcira dans la seringue et le tube. Ajustez la taille de la pointe étirée et biseautée en fonction de la taille du canal biliaire commun et de la veine porte de la souris, en fonction de son âge, de son génotype et de son phénotype. Si vous n’êtes pas sûr de la taille et de l’ajustement du tube, insérez le tube dans le conduit ou le récipient approprié après l’incision et avant que le tube ne soit rempli de résine. Si le tube est trop large pour tenir dans le conduit / récipient, étirez-le davantage. Anesthésier l’animal par inhalation d’isoflurane (d’abord 4% dans la chambre d’induction et ~2% en utilisant le cône de nez). Placez la souris sur un banc ventilé sur un coussin de dissection pendant que la souris respire de l’isoflurane par le cône du nez. Vérifier que l’animal est inconscient par une méthode recommandée par l’institut ou la CISR, par exemple en pinçant l’une des pattes.ATTENTION : L’isoflurane peut causer de la somnolence ou des étourdissements lors de l’inhalation et peut causer des dommages au système cardiovasculaire et au système nerveux central par une exposition prolongée ou répétée. Ne l’inhalez pas. Manipulez la substance sur un banc ventilé et dans des endroits bien ventilés.REMARQUE: Il est possible d’utiliser une autre méthode d’anesthésie, à condition qu’elle soit compatible avec la perfusion cardiaque. Une fois que l’animal est inconscient, vaporisez la face ventrale avec 70% d’éthanol pour éviter les interférences de la fourrure. À l’aide de ciseaux cutanés, coupez la peau, le fascia et la couche musculaire en commençant par la ligne médiane de la cavité abdominale et coupez jusqu’à la cavité thoracique pour exposer les organes internes. Saisissez le processus xiphoïde avec une pince pour soulever le sternum et coupez le diaphragme et la cage thoracique des deux côtés pour exposer le cœur et les poumons. Retirez la cage thoracique en coupant à travers les côtes des côtés gauche et droit de la cage thoracique avec des ciseaux. Prenez des précautions supplémentaires pour ne pas endommager le foie car cela entraînerait une fuite de la résine. À l’aide d’une pince droite, tirez le cœur vers le foie et coupez l’oreillette droite. Insérez une aiguille papillon (23 G), reliée à une pompe de perfusion péristaltique, dans le ventricule gauche. Perfuser la souris de manière transcardique avec une solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) et de l’héparine (1 U/g de poids corporel de la souris). Perfuser pendant 3 min avec un taux de perfusion de 5 mL/min.REMARQUE: Si la souris est perfusée correctement, les organes internes deviendront pâles, en particulier le foie. Si, au lieu de cela, les poumons deviennent blancs, l’aiguille est insérée dans le ventricule droit et doit être repositionnée. Après perfusion, la souris est exsanguinée et peut être retirée du cône nasal et de l’isoflurane. Éteignez la pompe à isoflurane. Injection de résine – Coulée de résine de système biliaireDéplacez la souris vers le microscope à dissection, l’abdomen vers le haut, la queue vers l’expérimentateur et éloignez-vous de l’expérimentateur. Les repères anatomiques d’intérêt sont représentés à la figure 2A. Localisez la veine cave inférieure (Figure 2A) en déplaçant l’intestin sur le côté. Utilisez des ciseaux à ressort pour faire une petite incision transversale dans la veine cave inférieure afin de permettre la libération de la pression vasculaire hépatique (Figure 2Bi). Exposez le canal biliaire commun et la veine porte comme décrit aux étapes 1.2.4 à 1.2.6. Déplacez l’intestin et le pancréas vers le côté droit (de l’expérimentateur) à l’aide d’un coton-tige mouillé par une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Retournez la face ventrale du foie vers le cœur à l’aide du coton-tige mouillé par PBS pour exposer la surface viscérale et la région hilaire. Localisez le canal biliaire commun qui s’étend de la région hilaire à travers le pancréas et dans l’intestin au niveau du sphincter d’Oddi (Figure 2Bii, canal biliaire commun délimité par la ligne pointillée jaune, les pointes de flèches noires pointent vers le sphincter d’Oddi).REMARQUE: Assurez-vous que le foie est humide tout au long de la procédure en le saupoudrant de PBS. Dégagez les tissus environnants (zone ~ 5 mm) du canal biliaire commun à l’aide d’une pince droite. Placer le fil de suture de soie (taille 4-0, 0,17 mm, 3 à 5 cm de long) sous le canal biliaire commun (Figure 2Bii) et nouer un nœud lâche autour du canal biliaire commun (Figure 2Biii).REMARQUE: Choisissez une zone pour le nœud à mi-chemin entre la région hilaire et le sphincter d’Oddi et à une certaine distance de la veine porte afin qu’une fois la suture resserrée autour du canal biliaire commun, elle n’interfère pas avec l’injection de la veine porte. Tenez les ciseaux à ressort à plat contre le canal biliaire commun pour faire une incision oblique au canal biliaire commun à l’endroit où le canal biliaire commun pénètre dans le pancréas et l’intestin à côté du sphincter d’Oddi. (Figure 2Biv), une ligne pointillée jaune délimite le sphincter de la région d’Oddi, souligné par des pointes de flèches noires).REMARQUE: Il s’agit d’une étape cruciale. Faites une coupe oblique et non transversale, et faites une incision; ne pas couper le canal biliaire. Couper à travers tout le canal biliaire rend l’insertion du tube très difficile. Juste avant utilisation, mélanger 1 mL de résine jaune avec 50 μL de l’agent de durcissement (en remplissant et en vidant la seringue de 1 mL) et remplir une seringue Luer de 1 mL avec le mélange résine -agent de durcissement. Connectez la seringue remplie avec le tube (ensemble #1). Appuyez sur le piston pour remplir complètement le tube. Assurez-vous que le mélange résine/agent de durcissement s’écoule de l’extrémité du tube.REMARQUE: Évitez et enlevez les bulles dans la seringue et le tube pour de meilleurs résultats. À l’aide d’une pince, redressez la zone autour de l’incision du canal biliaire commun et insérez le tube dans l’ouverture du canal biliaire commun (figure 2Bv), avec le bord le plus long de la pointe biseautée vers le bas vers la face dorsale du canal biliaire. Cette orientation garantit que la résine peut sortir de l’ouverture du tube, qui est orientée vers le haut, dans le conduit (Figure 2Bv). Serrez le nœud du fil de soie pour fixer le tube à l’intérieur du canal biliaire commun (Figure 2Bvi). Injecter la résine dans le canal biliaire commun. Observez la vésicule biliaire et les lobes hépatiques individuels. Massez le foie avec un coton-tige mouillé par PBS pour aider à répartir la résine de manière égale. Les branches terminales des voies biliaires remplies de résine (chez les souris de type sauvage) sont faiblement visibles à la surface du foie.REMARQUE: Le temps prévu pour remplir le foie est de 30 à 100 s. Arrêtez d’injecter la résine lorsque des points de résine apparaissent à la surface du foie (Figure 2Ci, pointes de flèche bleues) ou lorsque la résistance est rencontrée.REMARQUE: Travaillez aussi vite que possible puisque la résine commence à durcir après l’ajout de l’agent de durcissement de la résine. Le temps de travail résultant de l’ajout de l’agent de durcissement est d’environ 15 min. Retirez le tube en le tirant hors du canal biliaire commun et serrez rapidement le nœud de soie à l’aide d’une pince pour empêcher la résine de s’échapper. Coupez les extrémités lâches de la suture de soie afin qu’elles n’interfèrent pas avec l’injection de la veine porte. Éliminer les tubes contenant de la résine et la résine restante dans les déchets dangereux et l’aiguille dans les déchets d’objets tranchants. Injection de résine – Coulée de résine à veine portale Dégagez la veine porte (zone ~ 5 mm) de son tissu environnant à environ 2 cm de son entrée dans le foie à l’aide d’une pince droite. Placer le fil de suture de soie (taille 4-0, 0,17 mm, 3 à 5 cm de long) sous la zone dégagée de la veine porte (Figure 2Ci) et nouer un nœud lâche (Figure 2Cii). Faire une incision longitudinale dans la veine porte distale au foie et au nœud (Figure 2Ciii). Mélanger 1 mL de résine verte avec 50 μL de l’agent de durcissement (en remplissant et en vidant une seringue de 1 mL) et remplir la seringue Luer de 1 mL avec le mélange d’agent de durcissement de résine. Connectez la seringue remplie avec le tube (ensemble n ° 2 pour les souris >P30, nouvel ensemble n ° 1 pour les souris <P30). Appuyez sur le piston pour remplir complètement le tube. Assurez-vous que la résine s’écoule de l’extrémité du tube.REMARQUE: Évitez et enlevez les bulles dans la seringue et le tube pour de meilleurs résultats. À l’aide d’une pince, redresser la veine porte en tirant le tissu environnant vers l’expérimentateur et insérer le tube avec le bord le plus long de la pointe biseautée vers la face dorsale du vaisseau (Figure 2Ciii). Serrez le fil de soie pour fixer le tube dans la veine porte. Injectez la résine dans la veine porte. Observez les vaisseaux sanguins se remplir de résine. Massez le foie avec un coton-tige mouillé par PBS pour aider à répartir la résine de manière égale (Figure 2Civ). Arrêtez d’injecter la résine lorsque tous les vaisseaux sanguins sont remplis (les extrémités des veines porte sont visibles à la périphérie du foie) ou lorsque la résistance est rencontrée.REMARQUE: Travaillez rapidement car la résine commence à durcir après l’ajout de l’agent de durcissement. Le temps de travail de l’ajout de l’agent de durcissement est d’environ 15 min pour l’ensemble d’injection n ° 1 et de 25 min pour l’ensemble d’injection n ° 2. Retirez le tube en tirant le tube de la veine porte et serrez rapidement le nœud de soie à l’aide d’une pince pour empêcher la résine de s’échapper. Éliminer les tubes contenant de la résine et la résine restante dans les déchets dangereux et l’aiguille dans les déchets d’objets tranchants. Dissection et fixation du foieDisséquez tout le foie en le coupant du tissu environnant et du diaphragme. Placez doucement le foie entier dans un tube conique vide de 50 mL avec la face ventrale vers le haut et la face dorsale reposant sur la paroi du tube conique pour éviter toute déformation du foie. Conservez le tube conique horizontalement pendant la nuit à 4 °C pour que la résine durcisse complètement.REMARQUE: Tout récipient assez grand pour s’adapter au foie peut être utilisé au lieu d’un tube conique de 50 mL. L’utilisation d’un récipient à fond plat augmentera la probabilité que le foie ne soit pas déformé. Séparez le foie en lobes individuels. Faites une sélection des lobes qui seront utilisés pour l’analyse microCT (1.4.4-1.4.5) ou le contrôle de la qualité (1.4.6-1.4.8). En option, utilisez tout le foie pour le nettoyage optique et le microCT sans le séparer en lobes individuels.REMARQUE: L’architecture hépatique des systèmes biliaire et vasculaire est différente dans chaque lobe, et des analyses de lobe appariées sont donc nécessaires. Le nettoyage optique n’interfère pas avec le balayage microCT, et le ou les lobes utilisés pour le contrôle de la qualité peuvent ensuite être scannés avec microCT. Inversement, les échantillons scannés avec microCT peuvent ensuite être effacés optiquement pour comparaison. L’analyse de l’ensemble du foie est ainsi possible. Chez les souris de type sauvage (fond génétique C3H/C57bl6), le lobe médian droit est d’abord rempli par des injections de résine, ce qui en fait un lobe approprié pour l’analyse microCT, avec la reproductibilité la plus élevée. Le lobe latéral gauche est le plus grand lobe, dans lequel il est donc facile de pré-dépister la qualité de l’injection. La sélection du lobe (ou foie entier) utilisé pour le contrôle de la qualité et la microCT scan dépend du modèle animal et de la question de recherche. Dans une hotte ventilée, préparer une solution de formaldéhyde à 4% (10 à 20 mL par tube). Fixer les lobes utilisés pour le microCT avec 4% de formaldéhyde pendant la nuit à 4 °C et ensuite laver une fois avec du PBS (10 -20 mL par tube). Collectez les déchets de formaldéhyde dans un récipient séparé. Conservez les lobes hépatiques dans du PBS à 4 °C pour un stockage à court terme ou à 70 % d’éthanol pour un stockage à long terme. Passez à la section 2 : Micro-tomodensitométrie.ATTENTION : Le formaldéhyde provoque une toxicité aiguë en cas d’ingestion, d’inhalation ou de contact avec la peau. Le formaldéhyde est un liquide et une vapeur inflammables. Il provoque de graves brûlures de la peau et des lésions oculaires. Peut provoquer une réaction allergique cutanée. Fatal en cas d’inhalation (concentrée ou en poudre). Peut provoquer une irritation respiratoire. Soupçonné de causer des défauts génétiques. Peut causer le cancer. Provoque des dommages aux organes (yeux, système nerveux central). Conseils de prudence – tenir à l’écart de la chaleur, des surfaces chaudes, des étincelles, des flammes nues et d’autres sources d’inflammation. Défense de fumer. Portez des gants et des vêtements de protection. En cas de déversement, enlevez immédiatement tous les vêtements contaminés. En cas de contact avec la peau: rincer la zone contaminée à l’eau. En cas d’inhalation: retirer la personne à l’air frais et surveiller la respiration si elle est confortable. Appelez immédiatement un centre antipoison / médecin. Si dans les yeux: rincez les yeux à l’eau pendant plusieurs minutes. Si présent et possible, retirez les lentilles de contact. Pour le contrôle de la qualité, fixer les lobes restants (au moins un) avec 50% de méthanol (mélangé à de l’eau désionisée) pendant au moins 4 h, en se balançant à température ambiante, suivi d’un basculement à 100% de méthanol pendant la nuit à température ambiante. Collectez les déchets de méthanol dans un récipient séparé.ATTENTION : Le méthanol provoque une toxicité aiguë s’il est avalé, inhalé ou en contact avec la peau. Le méthanol est un liquide et une vapeur inflammables. Portez des gants et des vêtements de protection. Évitez de respirer lors de la manipulation et tenez-vous à l’écart du feu et de la chaleur. Lavez soigneusement la peau après l’utilisation. En cas de déversement, enlevez immédiatement tous les vêtements contaminés. Rincer la peau à l’eau. En cas d’inhalation: Retirez la personne à l’air frais et gardez-la à l’aise pour respirer. En cas d’inhalation, d’ingestion ou d’exposition, appelez un centre antipoison / médecin. Dans une hotte ventilée, préparer une solution d’alcool benzylique et de benzoate de benzyle (BA: BB, 1:2) (5-10 mL par lobe). Placer le lobe hépatique dans un tube en polypropylène de 15 ou 50 mL (selon la taille du lobe) contenant une solution BABB. Laissez-le basculer à température ambiante jusqu’à ce qu’il soit transparent. Cette étape peut prendre entre 2 et 16 h selon la taille du lobe.REMARQUE: La solution BABB dissout certains types de plastique. Il est sûr de stocker les échantillons dans des tubes en polypropylène ou des récipients en verre.ATTENTION : Le benzoate de benzyle peut provoquer une toxicité aiguë lorsqu’il est avalé. Il est toxique pour la vie aquatique avec des effets durables. Conseils de prudence : lavez soigneusement la peau après manipulation. Il est nocif lorsqu’il est avalé, en contact avec la peau ou inhalé. Évitez de respirer des fumées/vapeurs. Lavez-vous soigneusement les mains après la manipulation. Ne mangez pas, ne buvez pas et ne fumez pas lorsque vous utilisez ce produit. En cas d’ingestion – appelez un centre antipoison / médecin si vous ne vous sentez pas Bien Utiliser dans des endroits ventilés. Recueillir les déversements. Éliminer le contenu ou le contenant dans une usine d’élimination des déchets approuvée. Inspectez la qualité de l’injection. Seul le foie bien injecté doit être scanné avec microCT. 2. Micro-tomodensitométrie Préparation des échantillons Préparer 1% de gel d’agarose en mélangeant 100 mL d’eau distillée et 1 g de poudre d’agarose. Placer le mélange au micro-ondes et faire bouillir la solution jusqu’à ce que la poudre d’agarose se dissout. Tempérer le gel d’agarose à 1 % à ~40 °C pour éviter les dommages thermiques à l’échantillon de foie. Placez le(s) lobe(s) d’intérêt dans un tube conique de 15 mL et remplissez-le avec le gel d’agarose à 1% à environ 2/3 du volume total du tube. Cette étape minimise le mouvement indésirable de l’échantillon pendant la mesure CT. Mesure CTREMARQUE: Les étapes suivantes dépendent du périphérique CT et les paramètres et actions spécifiques peuvent différer selon les périphériques CT et les fabricants. Dans ce protocole, le scanner de micro-tomodensitométrie utilisé était équipé d’un tube à rayons X nanofocus (180 kV/15 W) et d’un écran plat dynamique 41|100 (4048 px x 4048 px, taille de pixel 100 mm avec binning 2) pour les mesures CT. Montez le tube conique de 15 mL avec l’échantillon sur l’étage de rotation d’un appareil CT et laissez-le s’adapter thermiquement à la chambre de mesure pendant au moins 1 h. Lorsque l’échantillon est adapté thermiquement, centrez-le dans le champ de vision (FOV). Optimisez les distances source-échantillon et échantillon-détecteur (SSD, SDD) pour atteindre une résolution voxel suffisante, par exemple 12 μm pour un échantillon de foie murin adulte ou 6,5 μm pour le foie <P30, correspondant aux dimensions du champ de vision (pour le matériel préalablement spécifié) 24,3 mm × 24,3 mm et 13,2 mm × 13,2 mm respectivement. Réglez les paramètres d’acquisition (c.-à-d. accélération de la tension et du courant, exposition, binning, moyenne) en suivant les recommandations du fabricant de l’appareil de tomodensitométrie pour atteindre un niveau suffisant de signal détecté. Ces paramètres dépendent non seulement de l’appareil de tomodensitométrie, mais aussi de l’échantillon et doivent être optimisés pour chaque échantillon. Dans Hankeova et al.9, les réglages étaient les suivants : tension d’accélération de 80 kV, courant d’accélération de 160 μA, temps d’exposition de 400 ms et 2000 images. Démarrez une mesure CT. Utilisez un logiciel de reconstruction tomographique dédié pour reconstruire les données CT. 3. Analyse et segmentation des données REMARQUE: Les étapes suivantes dépendent du logiciel de traitement d’image; les paramètres et actions spécifiques peuvent différer selon le logiciel utilisé. Pour charger les données CT : Sélectionnez Fichier > Importer > commande. Une sélection supplémentaire dépend du format spécifique des données CT à traiter. Utilisez la fonction Détermination de surface sur le panneau supérieur pour segmenter la résine dans les données à l’aide du seuil global. Dans la fenêtre de dialogue, déterminez la valeur seuil avec l’évaluation de l’histogramme en définissant la position de la ligne rouge « Isovaleur » pour segmenter uniquement les récipients remplis de résine (c’est-à-dire englobés par la ligne jaune dans le « Panneau d’aperçu » présenté ) (Figure 3A). Dans le panneau de gauche, sélectionnez le module Créer un retour sur investissement à partir du volume/CAO/maillage pour créer une région d’intérêt (ROI) des récipients remplis de résine. Dans la fenêtre de dialogue, utilisez l’option Créer un ou plusieurs retours sur investissement à partir de Solid, sélectionnez le nom du volume traité et confirmez. Éliminez la segmentation erronée des grappes de bruit dans la région d’arrière-plan de ce retour sur investissement. Marquez ce ROI sur le panneau de droite, faites un clic droit dessus et sélectionnez le module Split ROI. Dans la fenêtre de dialogue, définissez le paramètre Volume minimum [voxel] pour exclure toutes les particules de bruit – cette valeur dépend de l’expérience et des données et doit être optimisée pour chaque échantillon à analyser (Figure 3B). Créez des masques de canal lisses, continus et solides sans artefacts dans le retour sur investissement en résine – par exemple, présence de bulles d’air ou de fuites de résine. Dans le panneau de gauche, utilisez le module Lissage, définissez le paramètre Résistance au lissage sur 1 ou 2 (selon les données individuelles, lorsque des valeurs plus élevées peuvent entraîner une déformation du modèle, en particulier lorsqu’il s’agit de structures fines). Si nécessaire, exécutez ce processus deux fois (Figure 3C). Identifiez et séparez les systèmes tubulaires individuels dans le masque en résine segmenté. Créez un retour sur investissement distinct pour le système rempli de la résine la plus absorbante (la résine jaune utilisée pour l’injection courante des voies biliaires) avec des valeurs d’intensité plus élevées dans les données CT. Suivez la procédure décrite à l’étape 3.2. (Figure 3Di). Marquez le nouveau ROI et le ROI du masque de résine, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Soustraire le(s) ROI(S) et soustrayez le nouveau ROI du ROI du masque de résine pour créer un nouveau ROI pour le système tubulaire restant (Figure 3Dii, iii). Exportez les retours sur investissement résultants pour les deux systèmes tubulaires dans différents formats, en fonction des préférences de l’opérateur, pour un traitement ultérieur dans différents logiciels. En outre, traitez les retours sur investissement résultants dans un logiciel graphique de volume pour exporter la visualisation finale sous la forme d’une image ou d’une vidéo.

Representative Results

Que faireUne double injection de résine réussie est obtenue lorsque les voies biliaires intrahépatiques et le système vasculaire de la veine porte sont bien remplis. En tant qu’étape de contrôle de la qualité, le nettoyage d’un lobe (par exemple, le lobe latéral gauche) permet de vérifier une injection réussie, suivie de l’imagerie des lobes d’intérêt. Le lobe optiquement dégagé peut être scanné plus tard à l’aide de microCT; par conséquent, il est possible de nettoyer optiquement tout le foie. Dans le foie de souris bien injecté, le système vasculaire de la veine porte doit être rempli de résine jusqu’à ce que la périphérie du foie et la résine soient visibles dans les branches latérales (Figure 4), et cette architecture est fidèlement récapitulée dans des données scannées et segmentées microCT. En outre, les voies biliaires intrahépatiques bien injectées devraient être visibles à côté des branches de la veine porte principale s’étendant presque jusqu’à la périphérie, et la résine devrait être visible dans les principales branches latérales. Si le lobe de contrôle passe l’étape de contrôle de la qualité, les lobes d’intérêt (y compris celui optiquement effacé) peuvent être scannés avec microCT. Le résultat des données segmentées d’un foie bien injecté est montré pour une souris P15 (Figure 4A,B) et une souris adulte (Figure 4C,D). Ce qu’il ne faut pas faireUn tissu hépatique intact est une condition préalable à une injection réussie. Prenez des précautions supplémentaires lors de la coupe de la cavité abdominale et du diaphragme pour ne pas entailler accidentellement le tissu hépatique. S’il y a des dommages physiques au foie au cours de cette procédure, la résine est très susceptible de s’échapper lors de l’injection de veine porte (Figure 5A). Il n’est pas possible d’obtenir une bonne injection du système vasculaire si le foie est physiquement endommagé. L’une des erreurs courantes est de sous-remplir le foie avec de la résine qui peut entraîner des défis pour la visualisation ou l’analyse. L’une des causes du sous-remplissage du système est le durcissement prématuré de la résine dans l’aiguille ou la pointe du tube avant la fin de l’injection (Figure 5B, pointes de flèche bleues, crochets représentant de grandes bulles). Une bonne pratique consiste à utiliser un ensemble d’injection par animal et à travailler rapidement après l’ajout de l’agent de durcissement à la résine. Si la résine durcit pendant l’injection (ce qui peut être observé par un système à moitié rempli, illustré ici par une vascularisation de veine porte à moitié remplie), retirez le tube, coupez l’extrémité du tube (toujours en diagonale pour créer une pointe biseautée) et poussez le piston. Si la résine recommence à couler, réinsérez soigneusement le tube et fixez-le avec la suture. Si la résine a durci dans l’aiguille, remplacez complètement le tube, remplissez-le de résine (en évitant les bulles), réinsérez soigneusement le tube et fixez-le avec la suture. Il peut être difficile de remplacer le tube, en particulier chez les jeunes souris postnatales <P30, car le tissu est plus fragile. Une autre cause d’un mauvais remplissage en résine du système vasculaire de la veine porte peut être une perfusion transcardique insuffisante (Figure 5C, les pointes de flèche bleues indiquent le sang visible dans les branches terminales). Cela peut être observé lorsque les extrémités des vaisseaux sont remplies de sang au lieu de résine. Pour éviter cela, assurez-vous que la veine porte (à l’extérieur du foie) ne contient pas de sang avant l’injection. La troisième cause de foie sous-rempli est lorsque le tube est inséré trop profondément dans le foie et pénètre dans une branche vers l’un des lobes. Pour éviter cela, insérez le tube à un minimum de 0,5 cm de l’entrée du foie. Inversement, l’un des systèmes, ou les deux, sont surchargés de résine (Figure 5D). Il est nécessaire de surveiller visuellement le foie tout au long de l’injection. La coulée du système biliaire avec de la résine est plus difficile que la coulée de résine à veine porte, car les conduits remplis de résine ne sont que faiblement visibles à la surface du foie et il est difficile d’évaluer quand le système est presque plein et quand s’arrêter. Lorsque de petits points de résine jaunes apparaissent à la surface du foie (Figure 2Ci, pointe de flèche bleue), c’est un signe que le système biliaire est complètement rempli et que la résine commence à s’échapper des conduits. Les fuites mineures de résine peuvent être corrigées manuellement lors de la segmentation des données microCT (Figure 5D, panneaux de droite). Si la pression d’injection est trop élevée, cela peut provoquer la rupture des récipients ou des conduits (Figure 5E), endommageant de manière irréversible l’architecture des cuves ou des conduits. Le foie ne conviendra pas à la numérisation ou à l’analyse de microCT. Pour éviter le surremplissage de la résine, optimisez le volume et la pression appropriés utilisés pour l’injection dans chaque modèle de souris. Lorsque vous travaillez avec des souris qui ont été confrontées à un régime alimentaire toxique, à une modification génétique ou à une lésion hépatique affectant les systèmes biliaire ou veineux, ou à une raideur hépatique, la pression et le volume d’injection peuvent devoir être ajustés car le volume et la pression tolérés peuvent être différents de ceux des souris de type sauvage. Ce protocole décrit l’injection manuelle des deux systèmes, mais il est possible de connecter la seringue à une pompe pour normaliser la pression d’injection. Les bulles sont un autre artefact d’injection très courant qui conduit à un remplissage clairsemé des réseaux tubulaires (Figure 5F-H, pointes de flèches bleues). Pour éviter la formation de bulles, assurez-vous que la seringue et le tube ne contiennent pas de bulles, sont complètement remplis de résine et que la résine coule de l’extrémité du tube avant l’injection. Les petites bulles qui apparaissent comme des zones négatives sur les données microCT peuvent être corrigées manuellement pendant les étapes de post-traitement, bien que cela soit laborieux. Frais est le meilleurL’utilisation de résine jaune fraîche est un facteur crucial, affectant de manière significative le contraste des deux résines et la segmentation des données microCT. Lorsque la résine fraîchement ouverte est utilisée (figure 6A), il existe une nette différence de contraste entre les voies biliaires injectées de résine jaune (blanc vif) et les veines porte injectées de résine verte (gris vif). Le foie injecté avec de la résine fraîche est facilement traité à l’aide d’un seuil global automatisé. Avec un stockage prolongé, la résine précipite et le contraste diminue. Après 3 mois de stockage, le contraste peut encore être suffisant pour distinguer la veine porte du canal biliaire (Figure 6B), mais la précipitation affecte le mélange des deux résines, ce qui est visible sous la forme d’une opacité hétérogène dans la veine porte remplie (Fig 6B, pointes de flèches bleues). Le contraste hétérogène affecte négativement le seuil automatisé et nécessite des corrections manuelles, ce qui augmente le temps de traitement. Si la résine a plus de six mois, le contraste s’est dégradé à un point tel qu’il n’est pas possible de distinguer le canal biliaire injecté en jaune de la veine porte injectée en vert en fonction de leur seul contraste (figure 6C). Dans ce cas, le canal biliaire et la veine porte doivent être segmentés manuellement en fonction de leur diamètre et de leur position dans la région hilaire et suivis manuellement tout au long des données microCT. Cette procédure est extrêmement longue et il vaut mieux l’éviter. Figure 1 : Jeu d’injection pour la coulée de résine. (A) L’ensemble d’injection #1 comprend une aiguille de 30 G et un tube PE10 d’environ 30 cm de long. L’ensemble d’injection #2 est composé d’une aiguille de 23 G et d’un tube PE50 d’environ 30 cm de long. (B) La pointe du tube est étirée et coupée en angle pour créer une pointe biseautée. La règle en A et B est une règle centimétrique, avec des incréments majeurs de 1 cm, des incréments intermédiaires de 5 mm et des incréments mineurs de 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2 : Organigramme de coulée de résine double. (A) Schéma montrant le système circulatoire veineux murin et le cœur avec l’oreillette droite en surbrillance, qui doit être coupée avant la perfusion, et le ventricule gauche dans lequel l’aiguille doit être insérée pour la perfusion afin de laver le sang du système circulatoire. La veine cave inférieure doit être sectionnée sous les reins pour soulager la pression vasculaire. (B) Organigramme d’injection de résine de canal biliaire. (i) Image zoom de (A) montrant où couper l’IVC. (ii) Image représentant le canal biliaire commun (ligne pointillée jaune) de la région hilaire du foie au sphincter d’Oddi (pointes de flèches noires), avec un fil de suture sous le canal biliaire commun dégagé. (iii) Position appropriée pour le nœud lâche autour du canal biliaire commun. (iv) La ligne pointillée jaune et les pointes de flèche noires marquent le sphincter d’Oddi, démontrant l’angle oblique de l’incision et la façon dont l’ouverture doit apparaître après l’incision oblique. (v) Schéma montrant l’orientation de l’ouverture biseautée du tube PE10 (vers le haut) lors de l’insertion. vi) Apparition de la résine jaune injectée; la résine devrait facilement passer le nœud lâchement noué. IVC, veine cave inférieure; CBD, canal biliaire commun. (C) Organigramme d’injection de résine veineuse portale. (i) La ligne pointillée verte marque la veine porte de la région hilaire. Les pointes de flèche bleues étiquettent le système biliaire surchargé. (ii) Emplacement approprié pour le nœud lâche autour de la veine porte. iii) Schéma montrant l’ouverture en biseau (vers le haut) lors de l’insertion. iv) Apparition du foie lors de l’injection de résine verte et de résine jaune; notez le vaisseau sanguin rempli de résine dans la périphérie du foie. PV, veine porte. La figure 2A a été créée avec Biorender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Traitement des données micro CT dans un logiciel de graphiques de volume. (A) Détermination de la surface, (i) isovaleur surestimée (l’aperçu actuel de la sélection est affiché en couleur jaune), (ii) isovaleur sous-estimée, (iii) sélection optimale de l’isovaleur pour une détermination correcte de la surface de la veine porte et des voies biliaires. (B) Fractionnement de la région d’intérêt (ROI) créée par la détermination de la surface, (i) définissez la valeur dans la fenêtre de dialogue suffisamment haute pour qu’il ne reste qu’un seul segment (le plus grand), (ii) dans les cadres jaunes, les particules les plus petites (exclues) sont affichées. (C) Lissage de surface des données, (i) fonction de lissage est sur le panneau de gauche, (ii) réglez la force de lissage sur 1 (max. 2) et créez un nouveau retour sur investissement lissé, (iii) des données lissées. (D) Séparation des systèmes tubulaires individuels, (i) dans la fonction de détermination de surface définir l’isovaleur de sorte que seul le système biliaire soit inclus dans la sélection (l’aperçu actuel de la sélection est affiché en couleur jaune), (ii) marquer le roi des deux systèmes et le retour sur investissement du système biliaire uniquement et soustraire le retour sur investissement du système biliaire du retour sur investissement des deux systèmes, (iii) Veine porte représentée en gris, le système biliaire en vert. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Systèmes de voies biliaires (BD) et de veines portes (PV) bien injectés. (A) Lobe médian droit (LMR) optiquement dégagé du foie postnatal du jour 15 (P15) injecté avec deux résines dans les deux systèmes. Barre d’échelle 1 mm. (B) Rendu 3D de P15 RML illustré en (A) représentant la vascularisation de la veine porte en blanc et le système biliaire en vert. Barre d’échelle 1 mm. (C) RmL optiquement dégagée du foie adulte injecté avec deux résines dans les deux systèmes. Barre d’échelle 1 mm. (D) Rendu 3D de rmL adulte représenté en (C) représentant la vascularisation de la veine porte en blanc et le système biliaire en vert. H = hilaire, P = périphérique. Barre d’échelle 1 mm. Les panneaux A, B, D sont adaptés avec la permission de Hankeova et al.9. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Défis courants des injections hépatiques de double résine. (A) L’image représente un foie qui a été accidentellement entaillé lors de l’ouverture initiale de la cavité abdominale et la résine fuit à travers la coupe (pointe de flèche bleue). (B) Système de veine porte mal injecté en raison du durcissement de la résine. Des pointes de flèche bleues étiquettent les branches de terminal vides et des crochets rouges étiquettent les grandes bulles. Barre d’échelle 1 mm. (C) Système veineux portail mal injecté en raison d’une mauvaise perfusion transcardique. Des pointes de flèche bleues étiquettent le sang visible dans les branches terminales. Barre d’échelle 1 mm. (D) Système biliaire surchargé se manifestant par des boules isolées de résine. Les panneaux de gauche montrent le foie optiquement dégagé et les panneaux de droite montrent l’image rendue microCT 3D. Les contours pointillés bleus représentent les zones de zoom avant. Les pointes de flèche noires étiquettent une partie du foie qui a été endommagée lors de la clairière optique après le balayage microCT. Barre d’échelle 1 mm. (E) Une pression élevée lors de l’injection de résine peut provoquer une rupture de la veine porte (l’animal de ce panneau porte une mutation Jag1H268Q), marquée par des pointes de flèche bleues. Barre d’échelle 1 mm. (F) Bulles dans la résine lors de l’injection de la veine porte (pointes de flèche bleues) et (G) injection du système biliaire (pointe de flèche bleue), barre d’échelle 1 mm. (H) Balayage MicroCT des bulles (pointe de flèche bleue), branches terminales mal remplies (crochets rouges) et fuite de résine (pointe de flèche jaune), barre d’échelle 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 6: Contraste différentiel de la résine. (A) La résine jaune fraîchement ouverte génère un contraste suffisant pour distinguer la veine porte injectée de résine (grise) et les voies biliaires (blanches). (B) Trois mois de stockage de résine jaune entraînent une précipitation de la résine entraînant une opacité hétérogène (veine porte gris-blanc, pointe de flèche bleue). (C) Le stockage prolongé (>6 mois) de résine jaune diminue le contraste entre la veine porte (grise) et les voies biliaires (gris). Barre d’échelle 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Plusieurs étapes critiques déterminent le succès du DUCT, de la préparation de l’échantillon aux paramètres du dispositif CT. Pour obtenir les meilleurs résultats, une résine bien contrastée, bien injectée et sans bulles doit être utilisée pour permettre un traitement numérique simple avec seuil automatisé pour obtenir des données, des images et des films 3D. Avec la formation et le respect de ce protocole, 90% des injections sont réussies et aboutissent à des données reproductibles. Il est important d’utiliser de la résine jaune fraîche pour obtenir le meilleur contraste entre les deux systèmes injectés. La résine jaune a une très forte radiopacité, tandis que la résine bleue a une radiopacité indétectable. Les meilleurs résultats sont obtenus dans les trois premiers mois après l’ouverture d’une nouvelle bouteille en résine jaune. Avec le temps, la résine précipite, et après un stockage plus long (>6 mois), les résines jaunes et vertes ne seront plus distinguables dans les tomodensitogrammes. Les images avec un faible contraste nécessitent un traçage et une segmentation manuels étendus et longs des deux systèmes. Ensuite, un tube bien étiré est indispensable pour s’adapter au canal biliaire commun des souris adultes et au canal biliaire commun et à la veine porte des souris postnatales. Le point d’entrée de l’injection doit être créé avec soin. Si le canal biliaire commun est coupé transversalement, il est susceptible de se détacher du tissu environnant, empêchant ainsi l’entrée réussie du tube. Cette étape est particulièrement délicate pour les souris postnatales chez lesquelles le canal biliaire commun se rétracte et se recroqueville s’il s’est détaché de son tissu environnant, ce qui rend l’insertion du tube extrêmement difficile. L’entrée et l’injection courantes dans les voies biliaires peuvent nécessiter une certaine pratique. Lors de la préparation du tube avec de la résine et tout au long de l’injection, évitez la formation de bulles, car les bulles créeront un espace négatif dans les images CT et nécessiteront une correction manuelle fastidieuse. Il est important de masser doucement le foie en roulant sur sa surface avec un coton-tige mouillé pendant et après la procédure d’injection, car cela facilite même l’étalement de la résine. Après l’achèvement de l’injection et le retrait du tube, le nœud de suture en soie doit être serré rapidement et soigneusement, afin que la résine ne s’écoule pas du foie avant qu’elle ne polymérise complètement. Pour une imagerie microCT réussie, l’échantillon doit être correctement fixé en place avec de l’agarose et adapté thermiquement pour éliminer les artefacts de mouvement dans les données CT. Les paramètres d’acquisition sont également d’une importance capitale, qui doivent être optimisés pour atteindre une résolution spatiale adéquate afin de résoudre les structures fines.

Des modifications techniques à la procédure d’injection peuvent être apportées pour obtenir l’injection chez les souris plus jeunes. Actuellement, la coulée en résine de foies de souris plus jeunes est limitée par la disponibilité de tubes suffisamment minces, le PE10 étant le plus petit tube disponible dans le commerce. Tanimizu et al. ont injecté avec succès de l’encre de carbone dans le canal biliaire commun embryonnaire du jour 17 (E17) à l’aide de capillaires en ^verre11. Les futurs tests visant à déterminer si la résine peut être livrée par capillaire en verre seraient donc intéressants. DUCT a ensuite été adapté pour injecter d’autres systèmes tubulaires tels que les voies respiratoires et la vascularisation artérielle pulmonaire des ^poumons9. La double injection de résine pourrait également être modifiée pour être utilisée avec d’autres résines disponibles dans le commerce, ou ce protocole pourrait être utilisé pour des injections avec de l’encre carbone.

L’un des principaux facteurs limitants du pipeline DUCT est la viscosité de la résine. Le DUCT ne peut être utilisé que pour la coulée en résine de structures tubulaires au-dessus d’un diamètre de 5 μm. Dans cet ensemble de données, la résine pourrait pénétrer dans des tubes du plus petit diamètre de 5 ^μm9. Cette limitation de taille empêche l’analyse des canalisations fines et des petits capillaires. Pour faire progresser le pipeline DUCT vers des récipients de plus petit calibre, d’autres résines disponibles dans le commerce devraient être testées, ou le développement de nouveaux agents radio-opaques à faible viscosité pourrait améliorer la pénétration de la lumière.

Dans Hankeova et ^al.9, DUCT a été comparé à deux autres techniques couramment utilisées, les injections doubles d’encre de carbone suivies d’un nettoyage des tissus et d’une photographie standard, et iDISCO+ avec coloration des vaisseaux sanguins avec de l’actine et des voies biliaires alpha-lisses avec de la cytokératine 7, suivie d’une imagerie ^3D9. DUCT a surpassé les deux autres méthodes en termes de double analyse (ce qui était difficile pour iDISCO+ en raison de l’autofluorescence hépatique élevée), d’imagerie 3D et de quantification (impossible avec l’injection d’encre de carbone) et de luminosité (DUCT fournit des données pour l’architecture de la lumière interne et la perfusion du système). Comme mentionné ci-dessus, la principale limitation de DUCT est la taille minimale de la lumière qui peut être injectée et analysée (limite de 5 μm), un paramètre dans lequel l’injection d’encre carbone et iDISCO+ ont obtenu de meilleurs résultats. DUCT est supérieur à la coulée de résine à système unique3,5,6 car il permet d’analyser chaque système injecté séparément et facilite également la double investigation 3D pour étudier la relation architecturale entre les deux systèmes.

DUCT peut être appliqué pour étudier deux réseaux tubulaires quelconques en 3D. Comme preuve de principe, DUCT a été utilisé pour visualiser les systèmes biliaire et veineau du foie et le système vasculaire de l’artère pulmonaire et des voies respiratoires dans les ^poumons9. Les voies biliaires intrahépatiques se développent à côté de la veine porte, et la veine porte fournit un gabarit structurel et un centre de signalisation qui régule la croissance et la différenciation de l’arbre ^biliaire12. Dans Hankeova et ^al.9, DUCT a exploré la régénération biliaire dans un modèle murin pour la maladie pédiatrique humaine syndrome d’Alagille. DUCT a révélé des mécanismes architecturaux non signalés auparavant que le système biliaire utilisait pour atteindre un volume de type ^sauvage9. Les souris atteintes du syndrome d’Alagille ont utilisé deux stratégies différentes: (1) dans les régions hilaire et centrale du foie, le système biliaire a augmenté sa ramification, et (2) dans la périphérie du foie, les voies biliaires générées de novo étaient très tortueuses. Ces deux facteurs se sont combinés pour produire un volume de système biliaire presque normal, malgré l’architecture anormale. De plus, DUCT a détecté une ramification anormale des voies biliaires qui s’est produite indépendamment de la ramification de la veine porte et des voies biliaires formant des ponts de connexion entre deux veines ^porte9. Ces phénotypes seraient impossibles à détecter dans la coulée d’une seule résine et pourraient être mal interprétés dans les sections histologiques 2D comme une prolifération des voies biliaires. DUCT fournit ainsi des données décrivant l’architecture 3D de deux réseaux tubulaires au niveau de l’ensemble de l’organe ou du lobe avec la possibilité d’une analyse qualitative et quantitative approfondie. DUCT pourrait être une nouvelle norme pour les analyses postnatales du développement hépatique et de la régénération du foie dans différents modèles animaux.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Kari Huppert et Stacey Huppert pour leur expertise et leur aide en matière de canulation des voies biliaires et leur hospitalité de laboratoire. Nous remercions également Nadja Schultz et Charlotte L. Mattsson pour leur aide dans la canulation des voies biliaires communes.

Nous remercions les organismes subventionnaires suivants pour leur soutien :

Pour le travail dans ERA Lab: Karolinska Institutet (2-560/2015-280), Stockholms Läns Landsting (CIMED (2-538/2014-29)), Ragnar Söderbergs stiftelse (Bourse de démarrage des fondations suédoises), Association européenne pour l’étude du foie (Prix Daniel Alagille), Fondation suédoise cœur-poumon (20170723) et Vetenskapsrådet (2019-01350).

Pour le travail dans JK Lab: Nous reconnaissons l’infrastructure de recherche CzechNanoLab soutenue par MEYS CR (LM2018110). J.K. grâce au soutien de la subvention FSI-S-20-6353.

Materials

1.5 mL SafeSeal micro tubes	Sarstedt	72.706
23 G butterfly needle with tubing	BD bioscience	367283
25 G needle	BD bioscience	305122
30 G needle	BD bioscience	305106
Agarose	Top-Bio	P045
Benzyl alcohol	Sigma Aldrich	108006
Benzyl benzoate	Sigma Aldrich	B6630
Corning 50 mL tubes	Sigma Aldrich	CLS430829-500EA	polypropylene
Cotton swabs	Medicarier	60406
Dissection Microscope	Leica Camera AG		Leica M60
Dulbecco's phosphate-buffered saline	ThermoFisher Scientific	14190144
Ethanol 70%	VWR	83801.41
Falcon tube 15 mL	Verkon	331.850.084.006
Forceps curved	Fine Science Tools	11051-10	Fine Graefe 10 cm curved
Forceps straight	Fine Science Tools	11050-10	Fine Graefe 10 cm straight
Formaldehyde solution	Sigma Aldrich	F8775
GE Phoenix v\|tome\|x L 240	Waygate Technologoies		micro computed tomography scanner
Hanks' Balanced Salt Solution	ThermoFisher Scientific	14025092
Heparin	Leo Pharma	B01AB01	5000 IE/mL
Isolfurane	Baxter	FDG9623
Methanol	ThermoFisher Scientific	11413413
MICROFIL	Flowtech	MV-122	synthetic resin yellow
MICROFIL	Flowtech	MV-120	synthetic resin blue
MICROFIL	Flowtech	MV-diluent	clear resin diluent
Pasteur pipette	Verkon	130.690.424.503
Peristaltic pump	AgnThos	010.6131.M20
phoenix datos\|x 2.0 software	Baker Hughes		CT data reconstruction software
Rocker	VWR	444-0142
Silk suture	AgnThos	14757	Black silk, 4-0, sterile, 100 m
Skin scissor	Fine Science Tools	14058-09	Iris straight tip 9 cm
Spring scissor	Fine Science Tools	15000-03	Vannas micro, straight tip 2 mm
Syringe 1 mL Luer	BD bioscience	303172
Tubing PE10	BD bioscience	427401
Tubing PE50	BD bioscience	427411
VG Studio MAX 3.3 software	Volume Graphics GmbH		CT data processing and analysis software

Referanslar

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3D Liver Analysis DUCT Double Resin Casting Micro-computed Tomography Liver Vascular System Biliary System Liver Disease Liver Regeneration Bile Duct Common Bile Duct Resin Injection Liver Anatomy Liver Visualization

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Hankeova, S., Salplachta, J., Van Hul, N., Kavkova, M., Iqbal, A., Zikmund, T., Kaiser, J., Andersson, E. R. DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis. J. Vis. Exp. (175), e62941, doi:10.3791/62941 (2021).