감염 후 포도막염의 모델로서의 프라이밍 된 마이코 박테리아 포도막염 (PMU)

수행 된 모든 절차는 워싱턴 대학의 동물 관리 및 사용위원회 (동물 연구 프로토콜 # 4481-02) 또는 영국 내무부 라이센스 (PPL 30/3281) 및 브리스톨 대학 윤리 검토 그룹에 따라 현지에서 승인되었습니다. 두 기관에서 수행 된 실험은 안과 및 시각 연구에서 동물 사용에 대한 시력 및 안과 연구 협회 (ARVO) 성명서와 일치했습니다. PMU는 6-10주령의 C57BL/6J 마우스에서 생성되었고; 모든 마우스는 포도막염 유도시에 적어도 18g의 무게를 측정하였고, Crb1 유전자29의 RD8 돌연변이에 대해 음성으로 확인되었다. 마우스는 특정 병원체가없는 조건에서 표준 차우 및 약용 물 (아세트 아미노펜 200-300 mg / kg / day)로 유지되었습니다. 동물 안락사는 표준 이산화탄소 흡입 방법30을 사용하여 수행하였다. 1. 피하 주사를위한 항원 제제 Mtb H37Ra 분말과의 흡입 또는 피부 접촉을 방지하기 위해 화학 흄 후드 내부에서이 섹션의 모든 절차를 수행하십시오. 완전한 프로인트의 보조제(일반적으로 BSL-1)에 대한 기관 정책에 따라 처리하십시오. 여기에는 내화학성 장갑, 보안경 및 보호복(실험실 코트) 사용이 포함됩니다. 실험 동물에 도입 될 시약의 오염을 방지하기 위해 우수한 멸균 기술을 사용하십시오. 5mL 미세 원심분리 튜브에서 동결건조되고 열이 사멸된 M. 결핵 H37Ra 분말 5mg과 차가운 PBS 2.5mL를 혼합하여 PBS에서 Mtb 현탁액을 만듭니다. 30초 동안 한 번 소용돌이친 다음 얼음 위에 놓습니다. PBS에서 H37Ra의 미세한 현탁액을 생성하려면 5분 동안 얼음 위에서 현탁액을 초음파 처리합니다.변환기 장치의 본체를 풀고 70%(v/v) 알코올 면봉으로 프로브를 청소합니다. 초음파 처리기를 켜고 전원 제어 손잡이를 돌려 전원 설정을 4로 조정하고 프로브의 팁을 PBS 함유 마이코박테리아 분말에 담그십시오. 프로브 팁이 샘플 깊이의 절반 이상에 잠겨 있고 프로브 팁이 미세 원심분리 튜브의 벽에 닿지 않는지 확인하십시오. 혼합물을 얼음에 30 초 동안 초음파 처리하고 30 초 동안 일시 중지하고 총 5 분 동안 반복하여 액체를 가열하지 않고 분말을 균일 한 현탁액으로 완전히 분산시킵니다. 혼합물에 2.5mL의 프로인트 불완전 보조제를 첨가하고 에멀젼이 치약과 같은 일관성을 형성 할 때까지 얼음에서 초음파 처리 과정을 반복하십시오. 컨트롤 노브를 사용하여 전원을 0으로 설정하고 장치를 꺼서 초음파 처리를 종료합니다. 서스펜션에서 팁을 제거하고 알코올 면봉으로 프로브를 닦습니다. 항원 에멀젼을 4°C에서 보관한다. 에멀젼의 배치를 만들면 실험 전반에 걸쳐 일관성을 보장하는 데 도움이 됩니다. 에멀젼은 4°C에서 최대 3개월 동안 보관할 수 있습니다. 2. 피하 주사 유리체 내 주사 (-7 일로 지정) 일주일 전에 피하 주사를 수행하십시오. 1mL 주사기(바늘이 부착되지 않음)에 마이코박테리아 에멀젼을 넣습니다. 에멀젼의 점도와 불투명도로 인해보기 어려운 기포가 주사기를 채울 수 있습니다.주사기의 기포를 방지하려면 0.2-0.3mL의 에멀젼을 넣은 후 주사기를 뒤집고(팁이 위를 향함) 카운터 가장자리에서 주사기를 반복해서 가볍게 두드려 기포를 표면으로 가져옵니다. 주사기에서 공기를 배출하고 주사기를 계속 채우십시오. 반전하고 채워질 때까지 간헐적으로 탭합니다. 주사기에 25G 바늘을 놓고 바늘을 채우기 위해 에멀젼을 전진시킵니다. 사용할 때까지 주사기를 얼음 위에 보관하십시오. 피하 주사를 안전하게 수행하기 위해, 마우스를 마취하거나 동물 뒷부분(31)에 쉽게 접근할 수 있는 인도적 구속 방법을 이용한다. 피하 주사를 위해 마취하려면 동물을 이소플루란 유도 챔버(유도의 경우 3%-4%, 유지의 경우 1%-3%)에 두십시오. 마취되면 마우스의 호흡 속도가 느리고 호흡 곤란의 징후가 없는지 확인하십시오. 엉덩이의 등쪽 표면 또는 사타구니 림프절 부위에 인접한 다리의 복부 표면에 피하 주사를하십시오.근육에 주입되지 않도록 바늘을 조심스럽게 삽입하십시오. 0.05mL의 Mtb 에멀젼을 피하 공간에 주입합니다. 두꺼운 에멀젼이 완전히 주입 될 수 있도록 바늘을 즉시 제거하지 마십시오. 동물 당 총 0.1 mL에 대해 왼쪽과 오른쪽 양쪽에 주사를 반복하십시오. 마취 된 경우 완전히 회복 될 때까지 마우스를 따뜻한 가열 패드에 놓습니다. 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 마우스를 방치하지 마십시오. 완전히 회복되면 마우스를 케이지로 되돌리고 케이지 카드에 피하 주사 날짜를 표시하십시오. 항염증제가 포도막염 유도에 영향을 줄 수 있으므로 경구 용 아세트 아미노펜 (200mg / kg / 일)으로 진통제를 제공하지만 NSAID는 제공하지 마십시오. 3. 유리체내 주사를 위한 항원 스톡 제제 유리체내 Mtb 현탁액의 오염을 방지하기 위해 적절한 멸균 조건에서 이 섹션의 모든 절차를 수행하십시오. 유리체 내 현탁액을 만드십시오.경증에서 중등도의 판포도막염을 유도하려면 1x PBS 1mL에 마이코박테리아 추출물 5mg을 추가하여 5mg/mL 농도로 유리체내 현탁액을 만듭니다. 중등도에서 중증의 판포도막염을 유도하려면 10mg의 마이코박테리아 추출물을 1mL의 1x PBS에 추가하여 10mg/mL 농도로 유리체내 현탁액을 만듭니다. 30초 동안 한 번 소용돌이친 다음 얼음 위에 놓습니다. PBS에서 H37Ra의 미세 현탁액을 생성하려면 단계 1.4에 설명된 대로 10분 동안 얼음 위에서 현탁액을 초음파 처리합니다. 이 스톡 용액을 100 μL 부피로 분취하여 -20°C에서 보관한다. 사용하기 전에 실온에서 해동하고 고온에서 1분 동안 와류를 일으키십시오. 동물 시설로 운송하는 동안 분취량을 얼음 위에 보관하십시오. 4. 0일째 유리체내 주사 시술 동물 준비장착 된 검사 장갑을 착용하고 마우스를 저울에 올려 무게를 그램 단위로 얻습니다. 동물을 마취하기 위해 멸균수와 혼합 된 100mg / mL 케타민과 20mg / mL 자일 라진을 함유 한 용액 0.02mL / g의 복강 주사를하십시오. 대안적인 접근법은 ~1.5% 이소플루란(흡입)을 사용한 유도를 포함한다. 마우스가 잠들 때까지 약 2분 정도 기다린 다음 마우스를 보온 상자에 넣고 덮개를 덮습니다. 귀, 발가락 및 꼬리 꼬집음과 같은 통증 반사 테스트를 수행하여 절차32에 대한 마취 깊이를 평가합니다. 잠이 들면 0.5 % (v / v) 테트라 카인 1 방울로 각막을 마취하십시오. 마우스의 코 나 입 근처에 테트라 카인이 들어 가지 않도록하십시오. 10 초 후 여분의 액체를 두드리십시오.참고: 홍채 확장 및 전방(AC) 시각화는 국소 마취를 시행할 때 개선되는 것으로 관찰되었으며, 이는 전신 및 국소 마취를 병용한 각막 반사 억제로 인해 개선되었기 때문일 수 있습니다. 그러나 원하는 경우 이 단계를 생략할 수 있습니다. 2.5 % (v / v) 페닐에 프린 1 방울로 동공을 확장하십시오. 코나 입에 들어갈 수 있는 과도한 비말을 피하도록 주의하십시오. 2-3분 후 여분의 액체를 두드려 제거합니다. 안구 내염의 위험을 줄이려면 눈 표면과 주변 모발에 5 % 베타 딘 1 방울을 첨가하십시오. 눈에 2-3 분 동안 그대로 두십시오.알림: 안구내염을 예방하기 위해 적절한 멸균 조건에서 이 섹션의 모든 절차를 수행하십시오. 베타딘을 제거하고 하이프로멜로오스(0.3%) 또는 카보머 아이 젤 0.2% w/w)로 눈을 덮어 마취 시 건조함을 방지합니다. 이것은 또한 백내장 형성을 예방하는 데 도움이됩니다. 미세 주입 시스템 설정마이크로실린지 펌프 컨트롤러와 주사기에 연결된 마이크로펌프를 사용하여 유리체내 주입을 수행한다(그림 1A-C). 또는 하위 섹션 33에 설명된 대로 Hamilton 주사기에 부착된 4.4G 바늘로 주사합니다. 34G 바늘을 주입 홀더에 연결하여 인젝터를 조립합니다. 주입 홀더의 앞쪽 끝에 있는 은색 나사 캡을 풀고 바늘을 홀더 본체에 반쯤 밀어 넣습니다. 은색 나사 캡 손가락을 단단히 조입니다. 4.2.4-4.2.5단계에서 설명한 대로 튜브를 사출 홀더에 연결합니다. 사출 홀더에 튜브를 삽입하려면 홀더 뒤쪽 끝에 있는 플라스틱 나사를 풀고 내부의 개스킷을 통해 튜브를 밀어 나사를 조입니다. 주입 중 튜브 손상을 방지하기 위해 튜브 끝과 약간의 간격을 유지하십시오. 그림 1C를 참조하십시오. 마이코박테리움 스톡 현탁액의 100 μL 분취량을 해동시킨다. 3 μL의 1 % 플루오 레신 나트륨 (AK-Fluor) 용액을 넣고 잘 와동시킵니다. 10 μL 주사기에 기포를 포함하지 않고 항원과 플루오레세인 혼합물을 넣습니다. 주사기에서 로딩 바늘을 제거하고 팁이 주사기 본체의 제로 마크에 도달할 때까지 은색 나사 캡 개스킷을 통해 튜브를 밀어 넣습니다. 튜브 끝이 원하는 위치에 올바르게 정렬되면 나사 캡 손가락을 단단히 조입니다. 주입 튜브를 통해 주사기의 용액을 플러시하여 시스템을 완전히 로드합니다. 그런 다음 4.2.8-4.2.11 단계를 반복하여 주사기를 다시로드하여 주입합니다. 로드된 주사기를 마이크로 펌프에 설치하려면 cl을 누르십시오.amp 마이크로 펌프 끝에 있는 해제 버튼을 눌러 주사기 클램프를 엽니다. 플런저의 캡을 마이크로 펌프의 뒤쪽 끝에 있는 플런저 캡 홀더에 놓습니다. 그런 다음 주사기 칼라를 칼라 스톱에 밀어 넣고 주사기 본체를 주사기 클램프에 밀어 넣습니다. cl을 풉니다.amp 버튼을 누르고 플런저 고정 나사를 조입니다. 그림 1D를 참조하십시오. 주입 홀더와 바늘을 정위 주입 장치의 o-cl을 통해 밀어 넣습니다. 이것은 사용자 지정 플랫폼입니다. 또는 주사기를 수동으로 잡고 배치 할 수 있습니다. 마이크로 시린지 펌프 컨트롤러의 주입량과 주입량 속도를 각각 40nL/s의 속도로 사이클당 500nL씩 주입하도록 설정합니다.알림: 더 빠른 주입 속도를 사용할 수 있지만 바늘 위치 변경을 달성하기 전에 더 많은 역류가 발생할 수 있습니다. 유리체 주사를 수행하기 전에 시스템이 올바르게 작동하는지 테스트하십시오.알림: 주입 시스템이 올바르게 작동할 때 풋 페달 또는 컨트롤 패드를 사용하여 주입 주기를 활성화하면 플런저 캡 홀더가 눈에 띄게 움직이고 바늘 끝에 작은 녹색 액체 방울이 보입니다. 액체가 생성되지 않는 경우 추가 사이클을 활성화하거나 주사기를 세척하고 다시로드하십시오. 눈을 주사하기 전에 95 % 에탄올 패드로 바늘을 부드럽게 닦으십시오. 유리체 내 주사 절차마우스는 주입 절차를 수행하기 위해 정위 장치에 놓입니다. 마우스가 놓이는 스테이지/플랫폼은 표면에 2-3개의 종이 타월을 부착하여 따뜻하게 유지하십시오. 마우스를 플랫폼의 엎드린 위치에 놓습니다. 오른쪽 및 왼쪽 이어 바를 사용하여 동물의 머리를 부드럽게 고정하십시오. 그림 1E를 참조하십시오. 마우스를 배치하고 오른쪽 눈의 위쪽 비강이 보이도록 스코프 아래에 방향을 지정합니다. 30G 바늘을 사용하여 속눈썹을 옮기고 공막을 노출시킵니다. 윤부와 요골 혈관을 시각화하십시오. 멸균 된 30G 바늘을 사용하여 윤부 뒤쪽 1-2mm 공막에 가이드 구멍을 만드십시오. 주입 홀더에 부착 된 34G 바늘을 렌즈를 피할 수있는 각도로 가이드 구멍을 통해 눈에 삽입하되 바늘 끝을 유리체에 넣습니다. 마이크로 시린지 펌프 컨트롤러를 사용하여 1μL의 Mtb 추출물을 유리체에 조심스럽게 주입합니다. 지속적인 역류의 경우 적절한 용량 전달을 보장하기 위해 주입량을 1.5μL로 늘립니다.알림: 가짜 대조군의 경우 1μL의 PBS를 동물의 눈에 주입하십시오. 눈의 녹색 반사를 시각화하여 유리체 내 배치를 확인합니다. 그림 1F를 참조하십시오. 10 초 후 눈에서 바늘을 빼십시오. 역류에 유의하십시오. 플랫폼에서 마우스를 제거하고 각막 보호를 위해 양쪽 눈에 0.3% 하이프로멜로오스 또는 0.2% w/w 카보머 눈 연고를 바르고 회복 온난화 상자로 이동합니다. 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 마우스를 방치하지 마십시오. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사로 돌아 가지 마십시오. 마우스가 완전히 깨어 나면 케이지로 돌아가서 아세트 아미노펜 (200-300 mg / kg / day) 약용 물병을 넣으십시오. 케이지 카드에 IVT 주사 날짜를 표시하십시오. 유리체 내 주사는 일반적으로 잘 견딥니다. 통증과 연구에서 제거해야 할 필요성을 나타낼 수 있는 임상 징후에는 안구 주위 탈모증(자가 외상을 나타냄), 각막 궤양, 체중 감소 및 구부린 자세가 포함됩니다. 유리체 내 주사를위한 대체 방법알림: 이 절차는 작동 현미경과 미세 주사기의 33G 바늘을 사용하여 수행됩니다.눈을 쫓아 내고 한 쌍의 집게로 제자리에 고정하십시오. 그런 다음 카보머 아이 젤 0.2% w/w 또는 0.3% 하이프로멜로스 아이 젤을 바르고 원형 커버슬립(직경 7mm)을 눈 위에 놓습니다. 33μL Hamilton 주사기에 5G 피하 주사 바늘을 장착하고 ~2° 주입 각도로 각막 윤부에 약 45mm 원주를 삽입합니다. 바늘 경사를 유리체로 안내하여 렌즈와 시신경 디스크 사이에서 멈추고(외과의사의 상대적 관점에서 이것은 시신경 디스크 위/덮음 – 삽입 부위에서 약 1.5mm) 2μL의 Mtb(PBS에서 2.5ug/μL)를 천천히 주입합니다. 바늘을 제자리에 잠시 잡고 (주사제의 역류량을 줄이기 위해) 제거한 다음 제거하십시오. 주입 후 집게를 풀어 지구본을 배치하십시오. 이때 1% w/w 클로람페니콜 연고 한 방울을 눈에 투여하여 주사 후 안구내염으로부터 추가적인 보호를 제공할 수 있습니다. 주입 후 4.3.11-4.3.13단계에서 설명한 대로 복구 예열 상자로 이동합니다. 5. 포도막염을 검출하고 정량화하는 OCT 영상 동물 준비4.1.2-4.1.4단계에 설명된 대로 마우스를 마취합니다. 2.5 % 페닐에 프린 1 방울로 동공을 확장하십시오. 코나 입에 들어갈 수 있는 과도한 비말을 피하도록 주의하십시오. 2-3분 후 여분의 액체를 두드려 제거합니다. 0.3% 하이프로멜로오스 또는 0.2% w/w 카보머 젤을 눈에 바르면 마취 중 건조함을 방지할 수 있습니다. 이것은 또한 백내장 형성을 예방하는 데 도움이됩니다. 몸의 따뜻함을 유지하기 위해 마우스를 수술 거즈 층으로 감싸고 동물 카세트에 놓습니다. 바이트 바가있는 머리를 배치하십시오. 전방 및 후방 챔버의 OCT 이미지를 획득합니다.참고: 전방 및 후실 이미지를 얻는 경우 백내장 형성 후 이미지 저하를 방지하기 위해 먼저 후방(PC) 이미지를 얻으십시오. 백내장 형성은 자주 윤활하고 0.3% 하이프로멜로스 또는 0.2% w/w 카보머 아이 젤을 바르면 예방할 수 있습니다. 장시간 이미징(>10분)의 경우 마우스를 따뜻하게 유지(열 패드 사용)하는 것도 도움이 됩니다.OCT 이미징 시스템을 켠 후 올바른 이미징 렌즈를 고정하고 필요에 따라 기준 암 위치를 조정합니다. 이미징 소프트웨어를 열고 고유한 마우스 ID를 만든 다음 OCT 제조업체의 프로토콜에 따라 이미징을 시작합니다. 빠른 스캔 프로토콜과 함께 Free Run 옵션을 사용하여 시신경이 후실 이미지를 중심으로 하거나 각막 정점이 전방 이미지에 위치하도록 눈을 배치합니다.참고: 표 1 에는 상업적으로 이용 가능한 두 개의 소형 동물 이미징 시스템에 대한 이미징 프로토콜 매개변수가 포함되어 있습니다. 제품 사양에 대해서는 재료 표를 참조하십시오. 후실 영상의 경우 OCT를 눈 표면에 가깝게 가져옵니다. 렌즈 표면이 눈에 닿지 않도록 주의하십시오. 눈의 위치가 올바르게 지정되면 빠른 스캔을 중지하고 볼륨 스캔 프로토콜을 선택한 다음 조준 옵션으로 스캔을 활성화합니다. 후방 세그먼트 이미지의 경우 시신경이 수평 B-스캔 정렬 이미지의 중앙에 있고 망막이 수직 정렬 축과 정렬될 때까지 조정합니다. 전방 세그먼트 이미지의 경우 수평 B-스캔 정렬 이미지와 수직 정렬 B-스캔 정렬 이미지 모두에서 각막의 정점을 중앙에 배치하도록 위치를 조정합니다. 두 이미지에 반사 아티팩트가 있으면 적절한 정렬이 확인됩니다. 그런 다음 반사 아티팩트를 제거할 수 있을 만큼 수평 이미지를 이동합니다. 그림 2를 참조하십시오. Snapshot을 클릭하여 볼륨 스캔 이미지를 캡처한 다음 저장을 클릭합니다. 다음으로, 평균화된 중앙선 스캔을 구한다. 스캔 프로토콜을 열고 조준 을 클릭한 다음 스냅샷을 클릭합니다. 동일한 패널을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 평균을 클릭합니다. 두 렌즈로 각 눈에 대해 5.2.1-5.2.9단계를 반복합니다. 모든 이미지를 수집한 후 카세트에서 마우스를 제거하고 4.3.11-4.3.13단계에 나열된 대로 회복 중에 각막 보호 기능을 제공합니다. 6. OCT에 의한 염증 점수 매기기 치료 조건에 가려진 채점자의 도움을 받아 OCT 이미지에 점수를 매깁니다.참고: 마우스 모델의 PMU의 경우 표 2 에 제공된 점수 시스템을 사용하는 것이 좋습니다. 전방(AC) 및 후방(PC) 이미지를 모두 얻은 경우 이러한 점수를 결합하여 각 눈에 대한 최종 점수를 얻습니다.알림: 전방 염증은 후실 염증 전에 해결됩니다. 7. 사후 조직학에 의한 염증 점수 매기기 실험이 끝나면 핵 제거에 의해 개별 눈을 수집하고 밤새 4 % 포름 알데히드로 고정하고 파라핀 임베딩, 절편 및 H & E 염색33을 진행합니다.알림: 동공-시신경 축을 따라 여러 개의 4-8 μm 섹션을 권장합니다.참고: 눈당 3개의 섹션은 표 3에 제공된 채점 시스템을 사용하여 마스크를 쓴 채점자에 의해 채점되며, 3개의 섹션의 평균 점수는 최종 조직학 염증 점수로 보고됩니다.