Визуализация поглощения митохондриального Ca²⁺ в астроцитах и нейронах с использованием генетически закодированных индикаторов Ca²⁺ (GECI)

Митохондрии являются динамическими субклеточными органеллами и считаются клеточными электростанциями для производства энергии. С другой стороны, митохондрии могут поглощать Ca²⁺ в матрицу в ответ на локальное или цитозольное повышение Ca^2+. Поглощение митохондриальной Ca²⁺ влияет на митохондриальную функцию, включая метаболические процессы, такие как реакции в цикле трикарбоновой кислоты (TCA) и окислительное фосфорилирование, и регулирует Ca²⁺-чувствительные белки в физиологических условиях^1,2,3,4. Перегрузка митохондрий Ca²⁺ также является определяющим фактором гибели клеток, включая некроз и апоптоз при различных заболеваниях головного мозга^5,6,7. Это вызывает открытие переходных пор митохондриальной проницаемости (мПТП) и высвобождение кофактора каспазы, которые инициируют апоптотическую гибель клеток. Поэтому важно изучать динамику митохондриального Ca²⁺ и обработку в живых клетках, чтобы лучше понять клеточную физиологию и патологию.

Митохондрии поддерживают матричный гомеостаз Ca^{2 +} через баланс между поглощением Ca^{2 +} и эффлюксом. Поглощение митохондриального Ca²⁺ в основном опосредовано митохондриальными Ca²⁺ унипортерами (MCU), в то время как митохондриальный Ca²⁺ эффлюкс опосредован Na⁺-Ca^{2 +}-Li⁺ теплообменниками (NCLX) и H⁺/ Ca^{2 +} обменниками (mHCX)^8. Баланс может быть нарушен посредством стимуляции рецепторов, связанных с G-белком (GPCR)^9. Митохондриальный гомеостаз Ca²⁺ также подвержен влиянию митохондриальной буферизации путем образования нерастворимых комплексов xCa²⁺-xPO₄x-xOH^8.

Внутриклеточные и митохондриальные изменения концентрации Ca²⁺ ([Ca²⁺]) могут быть оценены по флуоресцентным или люминесцентным показателям Ca^2+. Связывание Ca²⁺ с индикаторами вызывает спектральные модификации, позволяющие регистрировать свободную клетку [Ca^2+]в реальном времени в живых клетках. В настоящее время доступны два типа зондов для мониторинга изменений Ca²⁺ в клетках: органические химические индикаторы и генетически закодированные индикаторы Ca²⁺ (GECI). Как правило, для исследуемых биологических вопросов доступны различные варианты с различными сродствами Ca²⁺ (на основе K_d),спектральными свойствами (волны возбуждения и излучения), динамическими диапазонами и чувствительностью. Хотя многие синтетические органические индикаторы Ca²⁺ использовались для цитозольной визуализации Ca^{2+, только} некоторые из них могут быть избирательно загружены в митохондриальный матрикс для визуализации митохондриального Ca^2+, причем Род-2 является наиболее широко используемым (для обзоров см.^10,11). Тем не менее, Rhod-2 имеет серьезный недостаток утечки во время длительных экспериментов; кроме того, он разделен между митохондриями, другими органеллами и цитозолом, что затрудняет абсолютные измерения в разных подкомпартментах. Напротив, используя специфические промоторы клеточного типа и последовательности нацеливания на субклеточный компартмент, GECI могут быть экспрессированы в различных типах клеток и субклеточных компартментах для клеточной и компартмент-специфической визуализации Ca²⁺ in vitro или in vivo. Одноволновые индикаторы интенсивности флуоресценции на основе GCaMP Ca²⁺ недавно стали основными GECI^{12,13,14,15,16.} В этой статье мы предоставляем протокол для нацеливания на митохондрии и специфической экспрессии GCaMP5G и GCaMP6s (GCaMP5G / 6s) в астроцитах и нейронах, а также визуализации поглощения митохондриального Ca^{2 +} в этих типах клеток. Используя этот протокол, экспрессия GCaMP6G/6s в отдельных митохондриях может быть выявлена, а поглощение Ca²⁺ в одном митохондриальном разрешении может быть достигнуто в астроцитах и нейронах in vitro и in vivo.