Imagerie de l’absorption mitochondriale de Ca²⁺ dans les astrocytes et les neurones à l’aide d’indicateurs ca²⁺ codés génétiquement (GECI)

Les mitochondries sont des organites subcellulaires dynamiques et sont considérées comme les centrales cellulaires pour la production d’énergie. D’autre part, les mitochondries peuvent absorber le Ca²⁺ dans la matrice en réponse à des augmentations locales ou cytosoliques de Ca^2+. L’absorption mitochondriale de Ca²⁺ affecte la fonction mitochondriale, y compris les processus métaboliques tels que les réactions dans le cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) et la phosphorylation oxydative, et régule les protéines sensibles au Ca²⁺dans des conditions physiologiques^1,2,3,4. La surcharge mitochondriale de Ca²⁺ est également un déterminant de la mort cellulaire, y compris la nécrose et l’apoptose dans divers troubles cérébraux^5,6,7. Il provoque l’ouverture des pores de transition de perméabilité mitochondriale (PTMP) et la libération de cofacteur caspase, qui déclenchent la mort cellulaire apoptotique. Par conséquent, il est important d’étudier la dynamique et la manipulation du Ca²⁺ mitochondrial dans les cellules vivantes pour mieux comprendre la physiologie et la pathologie cellulaires.

Les mitochondries maintiennent l’homéostasie de la matrice Ca²⁺ grâce à un équilibre entre l’absorption et l’efflux de Ca^2+. L’absorption mitochondriale de Ca²⁺ est principalement médiée par les uniporteurs mitochondriaux de Ca²⁺ (MCU), tandis que l’efflux mitochondrial de Ca²⁺ est médié par les échangeurs Na⁺-Ca²⁺-Li⁺ (NCLX) et les échangeurs H⁺/ Ca^{2 +} (mHCX)⁸. L’équilibre peut être perturbé par la stimulation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG)⁹. L’homéostasie mitochondriale Ca²⁺ est également affectée par la mise en mémoire tampon mitochondriale par la formation de complexes xCa²⁺-xPO₄x-xOH insolubles⁸.

Les changements intracellulaires et mitochondriaux de la concentration de Ca²⁺ ([Ca²⁺]) peuvent être évalués par des indicateurs de Ca²⁺ fluorescents ou luminescents. La liaison du Ca²⁺ aux indicateurs provoque des modifications spectrales, permettant l’enregistrement de cellules libres [Ca^2+]en temps réel dans des cellules vivantes. Deux types de sondes sont actuellement disponibles pour surveiller les changements de Ca²⁺ dans les cellules : les indicateurs chimiques organiques et les indicateurs ca²⁺ (GECI) codés génétiquement. Généralement, différentes variantes avec différentes affinités Ca²⁺ (basées sur K_d),des propriétés spectrales (longueurs d’onde d’excitation et d’émission), des plages dynamiques et des sensibilités différentes sont disponibles pour les questions biologiques étudiées. Bien que de nombreux indicateurs de Ca²⁺ organiques synthétiques aient été utilisés pour l’imagerie cytosolique du Ca^2+, seuls quelques-uns peuvent être chargés sélectivement dans la matrice mitochondriale pour l’imagerie mitochondriale ca^2+, Rhod-2 étant le plus largement utilisé (pour les revues, voir^10,11). Cependant, Rhod-2 présente un inconvénient majeur de fuite lors d’expériences à long terme; en outre, il est divisé entre les mitochondries, d’autres organites et le cytosol, ce qui rend difficiles les mesures absolues dans différents sous-compartiments. En revanche, en utilisant des promoteurs spécifiques au type cellulaire et des séquences de ciblage des compartiments subcellulaires, les GECI peuvent être exprimés dans différents types de cellules et compartiments subcellulaires pour l’imagerie Ca²⁺ spécifique aux cellules et aux compartiments in vitro ou in vivo. Les indicateurs GCaMP Ca²⁺ basés sur l’intensité de fluorescence à longueur d’onde unique sont récemment apparus comme des GECI majeurs^12,13, 14^,15,16. Dans cet article, nous fournissons un protocole pour le ciblage des mitochondries et l’expression spécifique du type cellulaire de GCaMP5G et GCaMP6s (GCaMP5G/6s) dans les astrocytes et les neurones, et l’imagerie de l’absorption mitochondriale de Ca²⁺ dans ces types de cellules. En utilisant ce protocole, l’expression de GCaMP6G/6s dans les mitochondries individuelles peut être révélée, et l’absorption de Ca²⁺ en résolution mitochondriale unique peut être obtenue dans les astrocytes et les neurones in vitro et in vivo.