Imagem Mitocondrial Ca²⁺ Absorção em Astrócitos e Neurônios usando Indicadores Ca²⁺ Codificados Geneticamente (GECIs)

Mitocôndrias são organelas subcelulares dinâmicas e são consideradas como potências celulares para produção de energia. Por outro lado, as mitocôndrias podem levar o Ca²⁺ à matriz em resposta aos aumentos locais ou citosóicos ca^2+. A absorção mitocondrial Ca²⁺ afeta a função mitocondrial, incluindo processos metabólicos como reações no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e fosforilação oxidativa, e regula as proteínas sensíveis ca²⁺em condições fisiológicas^1,2,3,4. A sobrecarga mitocondrial Ca²⁺ também é determinante para a morte celular, incluindo necrose e apoptose em vários distúrbios cerebrais^5,6,7. Causa a abertura de poros de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTPs) e a liberação do cofator caspase, que iniciam a morte celular apoptótica. Por isso, é importante estudar melhor a dinâmica mitocondrial ca²⁺ e o manuseio em células vivas para entender melhor a fisiologia celular e a patologia.

Mitocôndrias mantêm a matriz Ca²⁺ homeostase através de um equilíbrio entre a absorção de Ca²⁺ e o efflux. A captação mitocondrial Ca²⁺ é mediada principalmente por semportadores mitocondriais Ca²⁺ (MCUs), enquanto o efflux Mitocondrial Ca²⁺ é mediado pelos trocadores Na⁺-Ca²⁺-Li⁺ (NCLXs) e pelos trocadores H⁺/Ca²⁺ (mHCXs)⁸. O equilíbrio pode ser perturbado através da estimulação de receptores acoplados de proteína G (GPCRs)⁹. Mitocondrial Ca²⁺ homeostasis também é afetada pelo tampão mitocondrial pela formação de complexos insolúveis xCa²⁺-xPO₄x-xOH⁸.

Alterações intracelulares e mitocondriais na concentração de Ca²⁺ ([Ca²⁺]) podem ser avaliadas por indicadores fluorescentes ou luminescentes Ca^2+. A vinculação ca²⁺ aos indicadores causa modificações espectrais, permitindo o registro de celular gratuito [Ca²⁺] em tempo real em células ao vivo. Atualmente, dois tipos de sondas estão disponíveis para monitorar as alterações do Ca^2+nas células: indicadores químicos orgânicos e indicadores ca²⁺ (GECIs) codificados geneticamente. Geralmente, diferentes variantes com diferentes afinidades ca²⁺ (baseadas em K_d),propriedades espectrais (comprimentos de onda de excitação e emissão), faixas dinâmicas e sensibilidades estão disponíveis para as questões biológicas sob investigação. Embora muitos indicadores orgânicos sintéticos Ca²⁺ tenham sido utilizados para imagens citosócidas Ca^{2+, apenas} alguns podem ser carregados seletivamente na matriz mitocondrial para imagem mitocondrial Ca^2+, sendo Rhod-2 o mais utilizado (para revisões ver^10,11). No entanto, o Rhod-2 tem uma grande desvantagem de vazamento durante experimentos de longo curso; além disso, é particionada entre mitocôndrias, outras organelas e o citosol, dificultando as medições absolutas em diferentes subcomentamentos. Em contraste, usando promotores específicos do tipo celular e sequências de segmentação de compartimentos subcelulares, os GECIs podem ser expressos em diferentes tipos de células e compartimentos subcelulares para imagens Ca²⁺ específicas para células e compartimentos in vitro ou in vivo. Os indicadores GCaMP Ca²⁺ baseados em intensidade de comprimento único surgiram recentemente como principais GECIs^{12,13,14,15,16}. Neste artigo, fornecemos um protocolo para a segmentação de mitocôndrias e expressão específica do tipo celular de GCaMP5G e GCaMP6s (GCaMP5G/6s) em astrócitos e neurônios, e a absorção mitocondrial ca²⁺ de imagem nesses tipos de células. Usando este protocolo, a expressão de GCaMP6G/6s em mitocôndrias individuais pode ser revelada, e a absorção do Ca²⁺ em resolução mitocondrial única pode ser alcançada em astrócitos e neurônios in vitro e in vivo.