Imaging Dell'assorbimento mitocondriale di Ca²⁺ in astrociti e neuroni utilizzando indicatori Ca²⁺ geneticamente codificati (GECI)

I mitocondri sono organelli subcellulari dinamici e sono considerati le centrali cellulari per la produzione di energia. D’altra parte, i mitocondri possono assorbire Ca²⁺ alla matrice in risposta a aumenti locali o citosolici di Ca^2+. L’assorbimento mitocondriale di Ca²⁺ influenza la funzione mitocondriale, compresi i processi metabolici come le reazioni nel ciclo dell’acido tricarbossilico (TCA) e la fosforilazione ossidativa, e regola le proteine sensibili al Ca²⁺in condizioni fisiologiche^1,2,3,4. Il sovraccarico mitocondriale di Ca²⁺ è anche un fattore determinante per la morte cellulare, compresa la necrosi e l’apoptosi in vari disturbi cerebrali^5,6,7. Provoca l’apertura dei pori di transizione della permeabilità mitocondriale (mPTPs) e il rilascio di cofattore caspasi, che avvia la morte cellulare apoptotica. Pertanto, è importante studiare la dinamica e la manipolazione mitocondriale di Ca²⁺ nelle cellule viventi per comprendere meglio la fisiologia e la patologia cellulare.

I mitocondri mantengono l’omeostasi della matrice Ca²⁺ attraverso un equilibrio tra l’assorbimento di Ca²⁺ e l’efflusso. L’assorbimento mitocondriale di Ca²⁺ è mediato principalmente dagli uniportatori mitocondriali Di Ca²⁺ (MCU), mentre l’efflusso mitocondriale di Ca²⁺ è mediato dagli scambiatori Na⁺-Ca²⁺-Li⁺ (NCLX) e dagli scambiatori H⁺/Ca²⁺ (mHCX)⁸. L’equilibrio può essere perturbato attraverso la stimolazione dei recettori accoppiati alla proteina G (GPCR)⁹. L’omeostasi mitocondriale di Ca²⁺ è anche influenzata dal tamponamento mitocondriale dalla formazione di complessi insolubili xCa²⁺-xPO₄x-xOH⁸.

Le variazioni intracellulari e mitocondriali della concentrazione di Ca²⁺ ([Ca^2+])possono essere valutate mediante indicatori fluorescenti o luminescenti di Ca^2+. Il legame di Ca²⁺ agli indicatori provoca modifiche spettrali, consentendo la registrazione di cellule libere [Ca^2+]in tempo reale in cellule vive. Attualmente sono disponibili due tipi di sonde per monitorare i cambiamenti di Ca²⁺ nelle cellule: indicatori chimici organici e indicatori Ca²⁺ geneticamente codificati (GECI). Generalmente, diverse varianti con diverse affinità di Ca²⁺ (basate su K_d),proprietà spettrali (lunghezze d’onda di eccitazione ed emissione), intervalli dinamici e sensibilità sono disponibili per le questioni biologiche in esame. Sebbene molti indicatori organici sintetici di Ca²⁺ siano stati utilizzati per l’imaging citosolico di Ca^2+, solo pochi possono essere caricati selettivamente nella matrice mitocondriale per l’imaging mitocondriale Ca^2+, con Rhod-2 che è il più utilizzato (per le recensioni vedi^10,11). Tuttavia, Rhod-2 ha un grosso svantaggio di perdite durante esperimenti a lungo termine; inoltre, è suddiviso tra mitocondri, altri organelli e il citosol, rendendo difficili le misurazioni assolute in diversi sottocompartimenti. Al contrario, utilizzando promotori specifici per tipo cellulare e sequenze di targeting del compartimento subcellulare, i GECI possono essere espressi in diversi tipi di cellule e compartimenti subcellulari per l’imaging Ca²⁺ specifico per cellula e compartimento in vitro o in vivo. Gli indicatori GCaMP Ca²⁺ basati sull’intensità di fluorescenza a lunghezza d’onda singola sono recentemente emersi come principali GECI^{12,13,14,15,16.} In questo articolo, forniamo un protocollo per il targeting dei mitocondri e l’espressione specifica del tipo cellulare di GCaMP5G e GCaMP6s (GCaMP5G / 6s) in astrociti e neuroni e l’imaging dell’assorbimento mitocondriale di Ca²⁺ in questi tipi di cellule. Utilizzando questo protocollo, l’espressione di GCaMP6G/6s nei singoli mitocondri può essere rivelata e l’assorbimento di Ca²⁺ in risoluzione mitocondriale singola può essere ottenuto in astrociti e neuroni in vitro e in vivo.